郭凱敏劉凌云綜述 田潤(rùn)輝審校

1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院男科（吉林 130021）；2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院心理科

Src同源酪氨酸磷酸酶（Shp2）在雄性生殖調(diào)控的研究進(jìn)展

郭凱敏1劉凌云1綜述 田潤(rùn)輝2審校

1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院男科（吉林 130021）；2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院心理科

S r c同源酪氨酸磷酸酶（S r c h o m o l o g y phosphotyrosyl phosphatase2， Shp2）是非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase， PTP）家族成員之一，由蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（protein tyrosine phosphatase nonreceptor11，PTPN11）基因編碼并在人類細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞多種生物活動(dòng)，包括細(xì)胞的增殖、分化、有絲分裂、器官發(fā)育、免疫反應(yīng)以及代謝過程。已有大量研究顯示Shp2參與多種疾病的發(fā)生，如全身系統(tǒng)腫瘤（胰腺癌［1］、肺癌［2］、肝癌［3］、乳腺癌［4］等），在介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化過程中，Shp2是關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子，其作用已被廣泛揭示。而Shp2 在睪丸組織的表達(dá)以及調(diào)控精子方面的研究最近才成為熱點(diǎn)。本文就近些年Shp2在雄性生殖的調(diào)控方面做一綜述。

一、Shp2在睪丸細(xì)胞中的表達(dá)和定位

Shp2的結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)SH2（N-SH2和C-SH2）結(jié)構(gòu)域、一個(gè)單一的PPT區(qū)以及一個(gè)含有磷酸化位點(diǎn)的C端親水尾部結(jié)構(gòu)組成。由于和區(qū)之間的親密互作，它表現(xiàn)為一個(gè)低的基礎(chǔ)催化活性，以保持磷酸酶處于一個(gè)自動(dòng)抑制的封閉構(gòu)象。因此，它的催化活性需要通過釋放這些互作而打開，這個(gè)反應(yīng)發(fā)生在它的結(jié)構(gòu)域結(jié)合于在上游信號(hào)傳導(dǎo)搭檔上發(fā)現(xiàn)的特定磷酸酪氨酸基序［5］。目前普遍認(rèn)為Shp2在發(fā)育方面至關(guān)重要的作用離不開它在不同競(jìng)爭(zhēng)物的應(yīng)答中促進(jìn)Ras/MAPK通路激活，而且在許多雄性繁殖過程，包括精子發(fā)生、精子成熟、支持細(xì)胞和精原細(xì)胞粘附、以及血睪屏障的動(dòng)態(tài)性改變中，Shp2發(fā)揮了正向調(diào)控作用。

Puri等［6］應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)Shp2在睪丸支持細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞漿中高表達(dá)，而且在位于血睪屏障周圍生精小管基底膜部的支持細(xì)胞表達(dá)更為顯著，同時(shí)其表達(dá)水平在睪丸全部發(fā)育過程中基本保持穩(wěn)定。在睪丸生殖細(xì)胞中，Shp2表達(dá)于大部分未成熟的單個(gè)A形精原干細(xì)胞（As）和鏈狀A(yù)形精原干細(xì)胞（A aligned）精原細(xì)胞細(xì)胞核、胞漿以及質(zhì)膜。質(zhì)膜的Shp2檢測(cè)水平與質(zhì)膜受體磷酸酶的相互作用相關(guān)。而分化的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞不表達(dá)Shp2，其調(diào)控精原細(xì)胞分化機(jī)制方面目前尚不清楚。

二、Shp2維持精子生成

有研究顯示，Noonan 綜合征和Leopard綜合征都與Shp2的編碼基因PTPN11點(diǎn)突變有關(guān)，而這兩種先天性疾病均表現(xiàn)為男性不育［7，8］。Yoon等［9］發(fā)現(xiàn)Noonan 綜合征PTPN11點(diǎn)突變多達(dá)47種。Shp2完全缺失能引起胚胎原腸腔神經(jīng)節(jié)、脊索和脊索后延伸缺陷，造成胚胎發(fā)育停滯［10］。在維持成年小鼠精子生成方面，Puri等［6］通過哺育PTPN11floxed小鼠，將他莫昔芬結(jié)合蛋白結(jié)合域和泛素啟動(dòng)子融合到Cre重組酶，構(gòu)建了條件性基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)敲除29d后小鼠生精小管精原細(xì)胞和精母細(xì)胞缺失，敲除43d后除部分成熟的長(zhǎng)型精子細(xì)胞外，其余睪丸各級(jí)生精細(xì)胞均缺失。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)殘存的精子細(xì)胞分布散亂，個(gè)別細(xì)胞頂體部位變異。在敲除63d后，生精小管各級(jí)生精細(xì)胞均缺失。這提示Shp2 基因敲除可以影響未分化精原細(xì)胞的產(chǎn)生，而并不直接影響分化精原細(xì)胞和成熟精子細(xì)胞的存活。另外，Puri［6］將PTPN11floxed小鼠與 Vasa Cre 小鼠交配 建立了生殖母細(xì)胞特異性Shp2 基因敲除模型（GCPTPN11KO），此時(shí)胚胎發(fā)育15d，精原干細(xì)胞（SSC）未形成，3～4周時(shí)敲除小鼠生殖細(xì)胞進(jìn)行性減少，8周后生殖細(xì)胞全部消失，從而認(rèn)為Shp2 對(duì)出生后小鼠睪丸精子形成起重要作用。

小鼠出生后5d睪丸中可以存在兩種生殖母細(xì)胞，一種形成SSC ，負(fù)責(zé)后續(xù)精子的產(chǎn)生。另一類的生殖母細(xì)胞可以一次性繞過SSC和未分化精母細(xì)胞階段，這類細(xì)胞直接分化形成A1型精母細(xì)胞，進(jìn)而分化產(chǎn)生精子，稱為第一階段精子形成［11］。因此，研究發(fā)現(xiàn)GCPTPN11KO 小鼠可以正常形成第一階段精子，這與未分化精母細(xì)胞未檢測(cè)到Shp2表達(dá)一致［6］。這提示Shp2可能在維持A1分化精原細(xì)胞與和后續(xù)生殖細(xì)胞產(chǎn)生方面作用局限，而其重要作用表現(xiàn)在SSC增殖以及精子持續(xù)生成方面。與之相比，Shp2敲除小鼠出生后5d SSC和未分化精原細(xì)胞增加50%，而出生后7d由于細(xì)胞凋亡造成這些細(xì)胞下降60%?？梢奡hp2對(duì)SSC增殖和精子持續(xù)生成至關(guān)重要。已有研究顯示Shp2條件性基因敲除小鼠可以抑制多種類型細(xì)胞（如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞（HSC）、心臟祖細(xì)胞和T細(xì)胞）增殖［12］。Shp2抑制因子能夠通過SSC增殖啟動(dòng)子bFGF和GDNF調(diào)控，進(jìn)而抑制ERK信號(hào)激活，在體外抑制SSC增殖。

三、Shp2在SSC自我更新及分化中的作用

已有大量研究證實(shí)Shp2 在造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞更新分化中的作用［13-15］，而其在SSC的研究較少。SSC的自我更新主要由細(xì)胞因子GDNF、bFGF、集落刺激因子（CSF-1）、以及趨化因子配體（CXCL12）調(diào)控［16］。這些因子在SSC更新盡管沒有詳細(xì)的描述，然而GDFN和bFGF 在富集培養(yǎng)SSC中激活的AKT，介導(dǎo)的ERK磷酸化發(fā)揮作用已被廣泛認(rèn)可［17］。ERK和AKT激活產(chǎn)生的活性氧ROS刺激GFRA1和FGFR受體后可以促進(jìn)SSCs自我更新和增殖［18］。Shp2參與體細(xì)胞GDNF和bFGF介導(dǎo)的信號(hào)通路，以及在體外SSC中Shp2活性是GDFN和bFGF誘導(dǎo)ERK磷酸化的必要條件。目前尚不清楚是否在SSC中Shp2可以通過GDNF和bFGF調(diào)控AKT激活。因此，仍然需要進(jìn)一步研究證實(shí)Shp2是否能夠引起激活不同的AKT或ERK通路從而決定細(xì)胞自我更新或分化。

STAT3是一種促進(jìn)SSC分化和抑制自我更新的轉(zhuǎn)錄因子，由它調(diào)控的信號(hào)旁路可能是Shp2 介導(dǎo)的SSC分化的潛在靶點(diǎn)［19］。Shp2通過STATS3磷酸化將其激活［20，21］， STAT3激活后可以刺激SALL4表達(dá)，后者可以隔離ZBTB16基因，從而表達(dá)轉(zhuǎn)膜受體c-kit，最終促進(jìn)精原細(xì)胞分化［22］。STAT3 也可以誘導(dǎo)NGN3轉(zhuǎn)錄因子生成，后者再與E-box轉(zhuǎn)錄因子相互作用，引起促進(jìn)SSC分化基因的表達(dá)［23］。可見，Shp2介導(dǎo)的STAT3和NGN3下調(diào)是阻滯SSC分化的機(jī)制之一。SSC中Shp2的下游靶點(diǎn)ETV5和BCL6B也是SSC自我更新的重要轉(zhuǎn)錄因子［24］。而這些因子接受bFGF 和 GDNF通過PTPN11依賴的MAPK通路正向調(diào)控［25］（如圖1）。

圖1　Shp2激活SSC增殖、自我更新、分化的細(xì)胞通路

研究顯示，敲除生殖細(xì)胞Shp2基因能夠通過抑制SSC增殖而誘導(dǎo)生精阻滯，而敲除支持細(xì)胞Shp2基因可以干擾旁分泌因子的表達(dá)，促進(jìn)SSC過度分化［27］。后者基因敲除引起SSC來源的未分化精母細(xì)胞從出生后第二周開始迅速減少，以及分化成熟的精母細(xì)胞過早出現(xiàn)，同時(shí)Shp2可以很大程度上修復(fù)支持細(xì)胞細(xì)胞連接以及SSC克隆形成。早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白（PLZF）是SSC和未分化精母細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，基因敲除小鼠以及Shp2loxp/loxp小鼠中，PLZF陽性的細(xì)胞數(shù)只在出生后一周內(nèi)數(shù)量保持相同，隨著小鼠增齡數(shù)量急劇下降，支持細(xì)胞Shp2基因敲除引起SSC維持受損。此外，盡管目前尚不能明確促進(jìn)SSC自我更新基因表達(dá)的改變是否與Shp2基因敲除有關(guān)，但是Shp2缺陷的支持細(xì)胞中編碼分化促進(jìn)因子基因上調(diào)。這些研究提示支持細(xì)胞Shp2基因缺失破壞SSC維持自我更新和分化間的平衡，通過誘導(dǎo)SSC分化而阻止生殖細(xì)胞的補(bǔ)充儲(chǔ)備［27］?？梢?，支持細(xì)胞正常表達(dá)的Shp2是保持SSC自我更新和分化之間相互平衡的必要條件，也是維持精子持續(xù)生成和生育力的重要因素。

四、Shp2調(diào)控血睪屏障的完整性和SSC的附著

血睪屏障（BTB）是睪丸中毛細(xì)血管和支持細(xì)胞之間的緊密連接形成，將生精小管分為基底部和頂部，它為精原細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。血睪屏障破壞可以造成睪丸生精細(xì)胞脫落以及分化、發(fā)育阻滯［28］。血睪屏障周期性結(jié)構(gòu)更新可以促進(jìn)精原細(xì)胞從生精小管基底部向管腔部轉(zhuǎn)運(yùn)，其中激酶介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在血睪屏障維持和重塑中起關(guān)鍵作用。Puri等［6］研究發(fā)現(xiàn)組成性激活Shp2突變體SHP2Q79R的表達(dá)可以減小支持細(xì)胞跨膜電阻，從而破壞體外支持細(xì)胞之間的黏附。在生精周期一些特定階段，支持細(xì)胞和生精細(xì)胞會(huì)分泌一系列細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)BTB的開閉以及精子的形成［29］。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）是個(gè)調(diào)節(jié)血睪屏障重要的生長(zhǎng)因子，它可以刺激體外支持細(xì)胞增加SRC和ERK活性，減低細(xì)胞跨膜電阻，是Shp2的上游調(diào)控因子。Shp2可同HGF 受體（c-Met）銜接蛋白（Gab1）相互作用從而負(fù)調(diào)節(jié)MAPK通路激活［30］。

體外大鼠睪丸支持細(xì)胞的研究表明，組成性激活Shp2通過降低樁蛋白的磷酸化，引起負(fù)調(diào)節(jié)因子SRC與CSK解離，從而激活ERK，導(dǎo)致表達(dá)SHP2Q79R的支持細(xì)胞間粘附調(diào)節(jié)因子FAK 失活，穩(wěn)定細(xì)胞間黏附的細(xì)胞骨架破壞［31］。最終，組成性激活的Shp2改變引起緊密連接蛋白ZO-1，銜接蛋白β-catenin和轉(zhuǎn)膜蛋白N-cadherin從質(zhì)膜細(xì)胞粘附部位與支持細(xì)胞胞漿發(fā)生定位改變。這些表明Shp2對(duì)于維持SSC之間和SSC和支持細(xì)胞間黏附有重要意義。

五、Shp2調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞睪酮生成

睪酮是重要的雄性激素和合成代謝類固醇，在雄性中主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。促卵泡激素刺激間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生cAMP增加，激活蛋白激酶A，通過上調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)體急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，從而刺激激素合成通路合成類固醇。?；o酶A合成酶（ACSL4）和?；o酶A硫解酶（ACOT2）可以調(diào)控花生四烯脂氧化和環(huán)氧化代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，進(jìn)而增強(qiáng)STAR表達(dá)［32］。最近研究發(fā)現(xiàn)［33］Shp2是間質(zhì)細(xì)胞ACSL4 表達(dá)的重要調(diào)控因子，用Shp2的抑制劑NSC87877可以在體外抑制間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生睪酮。此外，shRNA調(diào)控的Shp2基因敲除引起的睪酮含量減少與ACSL4 和STAR蛋白含量減低相關(guān)。而Shp2過表達(dá)可以提高ACSL4和STAR蛋白以及睪酮的含量。Shp2能夠通過胞漿MAPK和PI4K-Akt通路調(diào)控FSH以及睪酮的產(chǎn)生。此外，Shp2基因敲除能夠抑制線粒體融合這一重要的睪酮產(chǎn)生過程［34］。

國(guó)內(nèi)學(xué)者蔡曉黎等發(fā)現(xiàn)，出生后小鼠Shp2連續(xù)性表達(dá)以及在特定發(fā)育階段表達(dá)量的明顯波動(dòng)，預(yù)示Shp2參與小鼠出生后睪丸發(fā)育的全過程，此外檢測(cè)小鼠血清中睪酮水平，發(fā)現(xiàn)Shp2在全部睪丸發(fā)育過程中的表達(dá)模式與小鼠血液中睪酮水平趨勢(shì)變化基本吻合［35］?？梢姡琒hp2對(duì)睪丸發(fā)育和睪酮生成持續(xù)發(fā)生作用。

綜上所述，Shp2在精子生成、精原細(xì)胞自身更新分化以及雄激素的生成方面起重要作用。目前Shp2研究還停留在動(dòng)物水平，在男性不育人群中的未見報(bào)道，對(duì)其深入研究有利于揭示男性不育癥的發(fā)病機(jī)理，同時(shí)也可能為不育的治療提供理論依據(jù)，Shp2抑制劑可能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手術(shù)結(jié)扎成為控制雄性生育的方法之一。總之，Shp2 能否應(yīng)用于實(shí)踐仍需要大量研究。

致謝：本文受吉林省財(cái)政廳科研專項(xiàng)資助（項(xiàng)目卡編號(hào)3D5157343428）基金項(xiàng)目資助

含SH2域蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶類； 精子發(fā)生； 雄激素類

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（2016-05-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.07.016

R 698.2