衣冠帥　劉雨辰　朱樹華

摘要：線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）是線粒體膜上的一種蛋白復(fù)合體，在線粒體介導(dǎo)的程序性死亡過程中起著重要作用。電壓依賴型陰離子通道蛋白（VDAC）是MPTP的重要組成蛋白，可調(diào)節(jié)其開放與關(guān)閉，但VDAC在植物體中的作用機理尚不明確。本試驗通過RT-PCR結(jié)合DNA末端快速擴增（RACE）方法，克隆得到肥城桃果實線粒體VDAC基因cDNA，全長共1225bp，其中編碼區(qū)828bp，編碼276個氨基酸；氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，桃果實VDAC與其它植物的VDAC蛋白具有較高的一致性；體外構(gòu)建了pET-30a-VDAC重組表達載體，并成功在大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達；使用鎳柱純化法，得到純化的重組蛋白，為下一步研究桃果實VDAc蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：肥城桃；線粒體；電壓依賴型陰離子通道蛋白（VDAC）；基因克??；生物信息學(xué)分析；蛋白表達

中圖分類號：S662.1+Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0001-07

線粒體存在于大多數(shù)真核細胞中，是細胞的微型“能量工廠”，在細胞疾病、衰老、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖和調(diào)節(jié)細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT）對細胞影響巨大，當其發(fā)生時，分子量在15kD以下的蛋白、一些離子和其它有害代謝物可以自由進出原本不允許通過的線粒體內(nèi)膜，導(dǎo)致其跨膜電勢消失、ATP合成受阻、線粒體滲透壓降低，最終使線粒體發(fā)生腫脹，甚至破裂。目前普遍的研究表明，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換受一種跨線粒體內(nèi)外膜的蛋白復(fù)合體調(diào)節(jié)，稱之為線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）。

線粒體電壓依賴型陰離子通道蛋白（VDAC）是線粒體外膜上的一種高度保守的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有物種的線粒體表面，是線粒體外膜上最豐富的蛋白，對于保持線粒體與細胞質(zhì)之間的物質(zhì)和能量代謝起著十分重要的作用。因此，VDAC被認為很有可能是MPTP的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，VDAC的超表達會導(dǎo)致細胞凋亡速率增加，這可能是由于VDAC蛋白含量的增高會導(dǎo)致其在線粒體膜表面形成多聚體，這種多聚體首先在植物體中被發(fā)現(xiàn)。通過對酵母菌、小鼠、人類等多種細胞的VDAC超表達研究發(fā)現(xiàn)，這些細胞發(fā)生凋亡的概率都有所升高。另有研究表明，伴隨VDAC超表達而產(chǎn)生的活性氧（ROS）的增加也是導(dǎo)致細胞凋亡的重要原因。

目前，關(guān)于VDAC蛋白在動物及人體中作用的研究已經(jīng)開展了很多，但在植物體中的研究還不是很成熟。本試驗以肥城桃果實為材料，克隆得到桃果實線粒體VDAC基因全長，并在大腸桿菌中成功表達獲得重組蛋白，以期進一步了解植物VDAC蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

肥城桃[Prunus persica（L.）Batsch cv.Feicheng]果實采自山東省肥城市桃園鎮(zhèn)。從長勢良好、無病蟲害的植株上隨機選取大小相近、色澤均勻、無機械損傷的桃果實，采摘后當天運回實驗室，4℃預(yù)冷24h。果肉切塊后用液氮冷凍處理，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌E.coli BL21（DE3）、DH50t，表達載體pET-30a質(zhì)粒均為本實驗室保存?？寺≥d體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司。

試驗所需引物（表1）由北京六合華大基因科技公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 肥城桃果實總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成參照改良CTAB法提取肥城桃果實總RNA。使用TaKaRa公司的PrimeScript Ⅱ 1st StrandcDNA Synthesis Kit試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.2.2 肥城桃果實線粒體VDAC基因中間序列的克隆從GenBank中查找其它植物的VDAC基因序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計簡并引物VDAC-F、VDAC-R，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后將目的片段切膠，使用Mini BEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0（TaKaRa）試劑盒進行DNA片段的回收。之后連接pMD18-T Vector，進行克隆載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。篩選陽性克隆，經(jīng)菌液PCR檢測后，送華大基因公司進行測序。

1.2.3 肥城桃果實VDAC基因全長的獲得及生物信息學(xué)分析根據(jù)中間片段的測序結(jié)果，設(shè)計RACE引物GSP1、GSP2及巢氏引物NGSP1、NG-SP2。使用SMARTerTM RACE cDNA（TaKaRa）試劑盒進行5'-RACE與3'-RACE。巢式PCR產(chǎn)物電泳切膠回收后，按上述方法構(gòu)建克隆載體、測序，將測序得到的5端序列和3端序列與中間片段拼接，得到VDAC基因全長序列。將全長序列在NCBI ORF Finder分析開放閱讀框，并在NC-BI數(shù)據(jù)庫中查找同源序列，使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列的比對分析，通過MEGA 4.1軟件分析桃果實VDAC與其它植物VDAC蛋白序列的進化關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。利用ProtParamtool（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析蛋白的理化性質(zhì)。利用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白的親水性。使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TM—HMM/）預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。最后使用在線網(wǎng)站提供的工具對VDAC蛋白進行二維及三維結(jié)構(gòu)的模擬。

1.2.4 VDAC蛋白的體外表達

根據(jù)VDAC的開放閱讀框，設(shè)計帶有酶切位點的引物VDAC-1、VDAC-2。經(jīng)PCR獲取VDAC全長片段，使用pMD18-T Vector按上述方法構(gòu)建克隆載體?？寺≥d體與pET-30a質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后將目的條帶切膠回收，使用TaKaRa T4 DNA Ligase進行連接，獲得重組質(zhì)粒pET-30a-VDAC。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達菌株BL21（DE3），經(jīng)菌液PCR驗證無誤后進行蛋白表達。取100μL菌液加入到50mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀=0.4～0.6，取1mL菌液用于對照，向剩余菌液中加入50μL1mol·L^-1IPTG至終濃度為1mmol·L^-1，37℃誘導(dǎo)過夜，取1mL菌液進行12%SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 重組VDAC蛋白的純化

使用His標記蛋白質(zhì)專用鎳柱介質(zhì)（Tiandz）進行蛋白純化，方法按照使用說明進行。用200mmol·L^-1咪唑洗脫液洗脫蛋白。純化后的VDAC蛋白進行SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 VDAC基因全長的獲得

通過對比不同植物VDAC基因序列，根據(jù)其保守區(qū)序列設(shè)計了簡并引物，以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板進行PCR，所得結(jié)果如圖1A所示，在500bp左右出現(xiàn)目的條帶，符合預(yù)期長度。將該條帶回收并克隆測序，根據(jù)此序列設(shè)計了RACE引物及巢氏引物。如圖1B，5-RACE巢氏PCR與3-RACE巢氏PCR均得到與預(yù)期長度相符合的目的條帶，將5-RACE與3-RACE測序結(jié)果與中間片段拼接，得到肥城桃VDAC基因全長序列共1225bp（圖2A），在GenBank中的登錄號為KJ652911.1。

2.2 VDAC基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)分析，該序列含有起始密碼子ATG（80bp）和終止密碼子TAG（909bp），具有完整的開放閱讀框。閱讀框共有828個堿基，編碼276個氨基酸，其氨基酸序列如圖2B所示。ProtParamtool預(yù)測蛋白分子式為C₁₃₂₈H₂₁₀₇N₃₅₉O₄₁₇S，分子量為29806.5D，理論等電點為7.88，不穩(wěn)定系數(shù)為12.67。ProtScale分析其疏水性平均值為-0.205，表明VDAC為親水性蛋白。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測VDAC為膜外蛋白。從二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖3A）可以發(fā)現(xiàn)，肥城桃VDAC蛋白在起始位置有一段α螺旋結(jié)構(gòu)，緊接著是無規(guī)則卷曲與β折疊結(jié)構(gòu)交替出現(xiàn)，總共有19段β折疊結(jié)構(gòu)。肥城桃VDAC三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果為桶狀（圖3B）。在二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中的β折疊結(jié)構(gòu)平行排列，圍繞成一個管道，而N端的α螺旋結(jié)構(gòu)則單獨位于管道的中間。進行對比。結(jié)果顯示，桃果實VDAC與其它植物VDAC氨基酸序列同源性較高，其中與橙子（Cit-rus sinensis）、白梨（Pyrus bretschneideri）、葡萄（Vi-tis vinifera）、麻風樹（Jatropha curcas）、荷花（Ne-lumbo nucifera）、巨桉（Eucalyptus grandis）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）的相似度分別為87.68%、94.57%、74.28%、84.06%、78.62%、72.10%、73.91%，說明植物的VDAC蛋白具有較高的保守性（圖4）。系統(tǒng)進化樹顯示，桃果實VDAC與白梨VDAC聚為一類，說明二者親緣關(guān)系最近（圖5）。

2.4 VDAC蛋白的體外表達及純化

使用T4連接酶將帶有酶切位點的VDAC基因片段與表達載體pET-30a連接，重組質(zhì)粒導(dǎo)人大腸桿菌B121（DE3），加入IPTG誘導(dǎo)表達，獲得VDAC重組蛋白。電泳結(jié)果（圖6A）顯示，VDAC重組蛋白成功表達，分子量約31kD。從菌液中分離出包涵體，用含尿素的結(jié)合液溶解，經(jīng)過鎳柱純化的VDAC重組蛋白（圖6B）中基本不含其它雜蛋白，純度較高。

3 結(jié)論與討論

本試驗采用同源克隆的方法獲得了肥城桃VDAC基因中間片段，之后根據(jù)中間片段設(shè)計RACE引物，獲得VDAC5及3端序列，通過拼接得到準確的肥城桃VDAC基因cDNA全長。對其進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，桃VDAC蛋白與其它植物VDAC蛋白具有較高的同源性。本試驗還體外重組了表達載體pET-30a-VDAC，在BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達得到VDAC重組蛋白，并利用Ni-NTA與帶有His標簽的VDAC重組蛋白結(jié)合，將目的蛋白從雜蛋白中分離出來。

Hiller等對從包涵體中復(fù)性的VDAC蛋白進行的核磁共振和X射線衍射分析發(fā)現(xiàn)，VDAC蛋白是由19段β折疊構(gòu)成的筒狀結(jié)構(gòu)蛋白。前人研究顯示，VDAC蛋白的N端存在長度為20個氨基酸的α螺旋結(jié)構(gòu)，這段螺旋結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一面疏水一面親水的性質(zhì)；在復(fù)性的或是失去活性的VDAC蛋白中，這段僅螺旋結(jié)構(gòu)始終位于VDAC蛋白的內(nèi)腔中，說明它在VDAC蛋白的結(jié)構(gòu)功能中有著重要的意義。對桃果實VDAC蛋白的三級結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果與已確定的人類VDAC1蛋白和煙草NtVDAC1.1蛋白極為類似。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，許多代謝產(chǎn)物和蛋白如ATP/ADP、活性氧、谷胱甘肽、己糖激酶等都表現(xiàn)出對線粒體通透性的調(diào)節(jié)作用，因此可以推斷VDAC蛋白參與了這些物質(zhì)對線粒體通透性的調(diào)節(jié)。其中，己糖激酶（HK）對體外重組的VDAC蛋白表現(xiàn)出直接的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，HK可以誘導(dǎo)VDAC關(guān)閉，而當HK從VDAC蛋白上釋放出來時，VDAC得以重新開啟。由此認為，HK誘導(dǎo)VDAC蛋白關(guān)閉進而抑制了MPTP的開放。另有研究表明，HK與VDAC在植物體內(nèi)存在共表達現(xiàn)象。更多關(guān)于肥城桃果實線粒體VDAC重組蛋白活性檢測、結(jié)構(gòu)分析的試驗正在進行中，將為MPTP的組成和功能、VDAC調(diào)控MPTP開放機理乃至細胞凋亡機制提供理論依據(jù)。