韓燕　馬登超　劉譯陽(yáng)　崔鳳　孫秀芹　李榮沖　萬(wàn)書(shū)波　李國(guó)衛(wèi)

摘要：以魯花14、Tifrunner和四粒紅為親本通過(guò)正、反交獲得的雜種F₁代群體為材料，結(jié)合親本間特異性單核苷酸多態(tài)性（single Nucleotide Polymorphism，SNP）位點(diǎn)，建立起一套利用限制性內(nèi)切酶酶切方法鑒定花生雜交F₁，代真假雜種的技術(shù)。結(jié)果表明，真雜種表現(xiàn)出父、母本帶型，而假雜種只表現(xiàn)出母本帶型；4個(gè)組合中F₁代真雜種率為10.5%～36.7%。因此，該技術(shù)能夠有效應(yīng)用于花生雜交F₁代的真假雜種鑒定。

關(guān)鍵詞：花生；SNP；雜種鑒定；限制性內(nèi)切酶

中圖分類號(hào)：S565.2+Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）04-0014-04

花生（Arachis hypogaea L.）也稱作長(zhǎng)生果，是我國(guó)重要的農(nóng)作物之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。通過(guò)雜交育種將優(yōu)良基因?qū)朐耘嗷ㄉ腔ㄉ耘喾N改良的主要手段。但是，目前有關(guān)花生真假雜種鑒別的途徑較為繁瑣，形態(tài)表型觀察仍是花生雜種真?zhèn)舞b別的主要方法。然而由于花生品種間遺傳基礎(chǔ)狹窄，形態(tài)表型差異較小，通過(guò)形態(tài)表型鑒別真假雜種難度較大，并且有較多的假陽(yáng)性。在基因組序列未知的條件下，利用人們已開(kāi)發(fā)出的多種分子標(biāo)記如SSR、Ah-MITE1等，對(duì)雜種后代進(jìn)行鑒定，得到了廣泛地應(yīng)用。

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polynor-phisms，SNP）是指由于單個(gè)核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等。SNP在基因組位點(diǎn)上呈現(xiàn)為單個(gè)核苷酸的變化，多發(fā)生在T和C之間。SNP在技術(shù)上有著較大的比較優(yōu)勢(shì)，它能夠穩(wěn)定地存在于生物體的整個(gè)基因組中，突變率低，在遺傳上常呈現(xiàn)惰性和顯性；此外，SNP能夠分辨等位基因上的差異，簡(jiǎn)單地對(duì)基因進(jìn)行分型，從而擺脫了電泳分型的瓶頸。在此基礎(chǔ)上，SNP成為繼RFLP和SSR后發(fā)展起來(lái)的第三代遺傳標(biāo)記，被廣泛運(yùn)用在動(dòng)植物性狀的關(guān)聯(lián)性研究中。在花生中，Zhou等利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，構(gòu)建了花生基于高密度SNP的遺傳圖譜。Chopra等利用下一代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定了市場(chǎng)上四類花生品種的SNP，結(jié)果顯示SNP可被有效用為分子標(biāo)記來(lái)鑒定花生品種資源。

本研究旨在建立一套利用不同花生品種問(wèn)存在的SNP位點(diǎn)，根據(jù)其多態(tài)性選取合適的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)有效引物，擴(kuò)增片段，利用上述酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切驗(yàn)證，根據(jù)其片段的多態(tài)性來(lái)簡(jiǎn)便、有效地鑒定花生F₁代真假雜種的鑒定技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以早熟直立大花生品種魯花14、匍匐型品種Tifrunner與四粒紅品種及以其作為親本正反交得到的F₁代群體為材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法提取花生基因組DNA。取新鮮幼嫩的葉片約0.5g，用液氮研磨成粉狀；加入0.5mL65℃預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液（使用前加入2%β-巰基乙醇），充分混合，65℃水浴30min，期間搖動(dòng)數(shù)次，12000r/min離心10min，取上清；加入等體積的酚+氯仿+異戊醇（25：24：1），緩慢顛倒混勻，12000r/min離心10min，取上清；加入等體積的氯仿充分混勻，12000r/min離心10min，取上清；加入等體積的冰凍異丙醇，置于-200℃冰箱中30min；12000r/min離心10min，棄上清液；用800μL70%乙醇漂洗2次，風(fēng)干；用50μL無(wú)菌水溶解DNA，置于-200℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系及程序 PCR擴(kuò)增體系（20μL）：正、反向引物（10μmol/L）各0.6μL，10×Buffer2μL，dNTPs（2mmol/L）2μL，MgSO₄（25mmol/L）1.2μL，KOD酶（1U/μL）0.4μL，50ngDNA模板1tμL，ddH₂O12.2μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及回收 將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中進(jìn)行水平電泳，電泳電壓130V，時(shí)間15min。電泳結(jié)束后在凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照。

在紫外光下對(duì)照Marker觀察電泳結(jié)果，用干凈的小刀從膠板上切下目的條帶。使用Axygen瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒對(duì)目的DNA片段進(jìn)行回收與純化，方法詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 F₁代雜種鑒定 對(duì)上述純化目的DNA片段進(jìn)行酶切反應(yīng)（10μL）：膠回收產(chǎn)物5μL、限制性內(nèi)切酶Hindm0.3μL、10×M Buffer（M Buffer為內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的Buffer）1μL、ddH₂O 3.7μL。37℃酶切5h。電泳觀察酶切片段的位置和大小。

酶切條帶表現(xiàn)為父母本雜合帶型的F₁代植株為真雜種，僅含有母本條帶的為假雜種。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間SNP位點(diǎn)篩選及引物設(shè)計(jì)

利用對(duì)魯花14、Tifrunner及四粒紅高通量測(cè)序及SNP分析的結(jié)果，從花生基因組中選取一段序列，該段序列中含有特異的SNP位點(diǎn)（圖1），該位點(diǎn)在魯花14與Tifrunner中表現(xiàn)為胞嘧啶（C），而在四粒紅中則突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）。該SNP位點(diǎn)前后6個(gè)堿基恰好為限制性內(nèi)切酶HindⅢ所能識(shí)別的酶切位點(diǎn)AAGCTT，而在四粒紅中則由于突變?yōu)門不能被HindⅢ識(shí)別。

以此段序列為模板，在其兩端設(shè)計(jì)正向引物TTTGCCAAGAGTACAAGCACA、反向引物CG-CAAGTAGTITCGCAAATG，該引物擴(kuò)增目的片段大小為755bp。

2.2 DNA質(zhì)量及產(chǎn)物特異性檢測(cè)

由于花生葉片中含有較多的次生代謝物及糖類雜質(zhì)，本試驗(yàn)在CTAB使用前加入2%β-巰基乙醇可有效地防止次生代謝物質(zhì)使DNA變色，同時(shí)在抽提的過(guò)程中多使用一次氯仿可以有效去除葉片中的蛋白質(zhì)，從而得到雜質(zhì)較少的DNA（圖2A）。以此DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，可有效、特異地?cái)U(kuò)增出目的條帶（圖2B）。

2.3 F₁代真假雜種鑒定

利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ分別對(duì)4個(gè)雜交組合的F₁代擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，部分材料的鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。魯花14、Tifrunner與四粒紅雜交組合的F₁代后代中，由于從魯花14或Tifrun-ner基因組序列獲得的片段具有HindⅢ的識(shí)別位點(diǎn)，因而擴(kuò)增產(chǎn)物能夠切出395bp和362bp兩條片段，兩條片段大小非常相近，故電泳只顯示為一條帶；而從四粒紅基因組獲得的片段不具有HindⅢ識(shí)別序列，故只有一條755bp的帶。因此，真雜種具有父母本的帶型，電泳顯示為兩條帶，而假雜種僅表現(xiàn)出母本的帶型，電泳顯示為一條帶。統(tǒng)計(jì)并計(jì)算各雜交組合的真雜種率（表1），魯花14與四粒紅正、反交組合的真雜種率分別為10.5%與25.9%，低于Tifrunner與四粒紅正、反交組合的真雜種率。

3 結(jié)論與討論

目前，花生真假雜種的鑒定往往采用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合DNA分子標(biāo)記技術(shù)。DNA分子標(biāo)記雖然具有多態(tài)性高、檢測(cè)靈敏等優(yōu)點(diǎn)，然而利用分子標(biāo)記進(jìn)行雜種鑒定時(shí)，對(duì)DNA的質(zhì)量要求較高，需要開(kāi)發(fā)篩選多對(duì)引物，因此鑒定過(guò)程較為繁瑣，不利于大規(guī)模的后代鑒定。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法，開(kāi)發(fā)出有效的SNP位點(diǎn)，首次鑒定了四粒紅與魯花14、Tifrunner的雜交后代。該方法既能快速有效、省時(shí)省力地鑒定花生基因型及真假雜種，又可為建立花生連鎖圖譜做準(zhǔn)備，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為高效利用花生種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)。