邱貞娜梁 武朱秀同郁宏偉柳 珊李曉艷劉 濤

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000）

溫度對豬圓環(huán)病毒培養(yǎng)滴度的影響

邱貞娜1，2梁 武1，2朱秀同1，2郁宏偉1，2柳 珊1，2李曉艷1，2劉 濤1，2

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000）

為了豬圓環(huán)病毒生產(chǎn)批次間滴度的穩(wěn)定性，提高病毒產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)對豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)溫度參數(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，病毒培養(yǎng)溫度36℃時，收獲毒液病毒滴度明顯下降，培養(yǎng)溫度為37℃和38℃時，病毒滴度基本持平，均能穩(wěn)定在較高水平。

豬圓環(huán)病毒；培養(yǎng)溫度；病毒滴度

0 引言

豬圓環(huán)病毒是（Porcine circovirus type 2，PCV2）一種圓形小顆粒病毒，粒子直徑為 17 nm，呈 20 面體對稱，無囊膜，CsCl 浮力密度為 1.37g/cm3，是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原。PCV2 感染可導(dǎo)致動物機(jī)體免疫系統(tǒng)功能嚴(yán)重受損，形成免疫抑制，增強(qiáng)對其它多種病原體的易感性，引起在正常情況下具有較低致病性的病原體感染發(fā)病，使豬群發(fā)生難以控制的復(fù)發(fā)性疾病和多重感染［1］。該病呈世界流行，我國的大型豬場普遍存在該病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失，疫苗免疫是控制PCV2 感染引起相關(guān)疾病的重要手段。

PK15細(xì)胞是PCV2敏感細(xì)胞系，被廣泛用于疫苗生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)就PK15細(xì)胞培養(yǎng)PCV2的溫度參數(shù)進(jìn)行了研究，以期找到最佳病毒培養(yǎng)溫度，保證疫苗生產(chǎn)中批次間的穩(wěn)定性，提高病毒產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和生物材料

豬腎傳代細(xì)胞系（PK-15細(xì)胞）和豬圓環(huán)病毒2型（ZJ-C株）由公司種毒室保存和提供；新生牛血清、MEM干粉培養(yǎng)基購自gibco公司；PCV2-cap單克隆抗體購自浙江同點(diǎn)生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠二抗購自KPL公司。

1.2 豬圓環(huán)病毒培養(yǎng)

長成良好單層的PK-15細(xì)胞，采用EDTA-胰酶消化，經(jīng)吹打分散均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種培養(yǎng)瓶，同時加入豬圓環(huán)病毒；分成3個試驗(yàn)組，分別于36℃、37℃和38℃培養(yǎng)，48h時棄去培養(yǎng)液，更換3%血清的維持液，再培養(yǎng)40h，收獲，將培養(yǎng)瓶反復(fù)凍融3次，取樣后冷凍保存。

1.3 病毒滴度測定

將病毒液用不含血清的MEM液10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7三個滴度接種96孔板，0.1ml/孔，每滴度6孔，同時接入0.1ml分散均勻的PK15細(xì)胞，37℃培養(yǎng)72h，冷丙酮固定，采用IFA法檢測，統(tǒng)計(jì)病毒感染孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞感染量（TCID50/ml）。

2 結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表1，可見豬圓環(huán)病毒培養(yǎng)溫度為37℃和38℃時，兩組病毒滴度基本持平，均能達(dá)到107.5TCID50/ml，維持在較高水平；培養(yǎng)溫度為36℃時，病毒滴度明顯下降，降幅接近0.5個滴度。

表1 不同培養(yǎng)溫度收獲毒液病毒滴度

3 討論

豬圓環(huán)病毒復(fù)制過程中，依賴宿主細(xì)胞的聚合酶，這種酶類主要是在細(xì)胞繁殖的S周期中合成，培養(yǎng)溫度能影響酶類的活力，從而影響病毒的復(fù)制，在豬圓環(huán)病毒培養(yǎng)過程中，要關(guān)注培養(yǎng)環(huán)境的溫度［2-3］。

本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，溫度低至36℃時，病毒的繁殖滴度明顯下降，豬圓環(huán)病毒疫苗生產(chǎn)中普遍使用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝，細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶置于溫室中，因?yàn)榭諝庋h(huán)不均，常常造成溫室內(nèi)溫度的不均衡，一些位置溫度偏低，這會造成大生產(chǎn)中豬圓環(huán)病毒滴度的下降，也是影響批間穩(wěn)定性的一大因素。而本次實(shí)驗(yàn)也證明，培養(yǎng)溫度達(dá)到38℃左右時，病毒滴度并沒有下降，所以在大生產(chǎn)中，可適當(dāng)提高整體環(huán)境溫度，減少低溫死角，提高病毒滴度，減少批次間的差異。

［1］ 宣長和，馬春全，陳志寶［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：172-180.

［2］ 劉長明，張超范，危艷武，等.豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株的培育和鑒定［J］.中國獸醫(yī)預(yù)防學(xué)報，2006，（3）：248-252.

［3］ 王憲文，姚四新，劉興友，等.豬圓環(huán)病毒2型復(fù)制及其影響因素［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，（3）：220-223.

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2014GB2A200324）