石軼男 聶瑞強(qiáng)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

雞十二指腸、法氏囊IFN-α基因的克隆和生物信息學(xué)分析

石軼男 聶瑞強(qiáng)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

IFN-α是干擾素的一種，其對(duì)動(dòng)物免疫力和抗病能力的增強(qiáng)有重要的作用，本試驗(yàn)首次通過(guò)PCR技術(shù)克隆雞十二指腸和法氏囊IFN-α基因，并使用生物信息學(xué)的方法分析IFN-α基因和蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，雞十二指腸、法氏囊都有IFN-α基因的表達(dá)，其是一種主要由α螺旋排列而成的蛋白質(zhì)。

干擾素；IFN-α；生物信息學(xué)

動(dòng)物免疫力和抗病能力的增強(qiáng)對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)有重要的意義。干擾素（interferon，IFN）是目前研究中最為活躍的細(xì)胞因子，其在機(jī)體的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)中有重要的作用［1］。IFN 產(chǎn)生后，不是直接發(fā)揮抗病毒和增強(qiáng)免疫的作用，其是通過(guò)激活相關(guān)的酶和作用通路來(lái)發(fā)揮作用的，其中包括JAK-STAT 途徑［2］，MAPK p38 途徑［3］和PI3K途徑。IFN-α是干擾素的一種，其是由白細(xì)胞產(chǎn)生的，在動(dòng)物機(jī)體提高免疫力和抗病毒能力中發(fā)揮著重要的作用。本文通過(guò)擴(kuò)增雞的十二指腸和法氏囊中的IFN-α基因，來(lái)驗(yàn)證IFN-α基因在雞的這兩個(gè)免疫器官中都有表達(dá)，同時(shí)，通過(guò)生物信息學(xué)的方法來(lái)分析其編碼蛋白的理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

PCR儀、DNA marker、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）

1.2 IFN-α基因的克隆

以雞十二指腸和法氏囊cDNA為模板使用普通PCR儀克隆IFN-α基因片段，同時(shí)使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.3 IFN-α基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

使用Protparam、NPS、 phyre2對(duì)IFN-α蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IFN-α基因序列的查找

在NCBI中，查到IFN-α基因序列的編號(hào)為GU119896.1。

2.2 IFN-α基因的克隆

設(shè)計(jì)出的引物目的條帶為189bp，通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們可以看到凝膠上的條帶大小在150～200bp，證明目的條帶為IFN-α基因。說(shuō)明雞十二指腸和法氏囊都有IFN-α基因的表達(dá)（圖1）。

圖1 IFN-α基因片段電泳圖

2.3 IFN-α蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用Protparam對(duì)IFN-α編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，IFN-α蛋白質(zhì)的分子式為C976H1526N296O282S8，原子總數(shù)3088，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量22175.1，理論等電點(diǎn)9.06，氨基酸總數(shù)193。在氨基酸組成上，亮氨酸Leu（L）最多，有28個(gè)，占14.5%?？偟膸ж?fù)電殘基（Asp+Glu）為14，總的帶正電殘基（Arg+Lys）為19。

2.4 IFN-α蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)NPS軟件預(yù)測(cè)可知，IFN-α蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋所占比例為39.38%，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例為52.85%（圖2）。

圖2 IFN-α蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖3 IFN-α蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以雞十二指腸和法氏囊的cDNA為模板，克隆IFN-α基因，并通過(guò)生物信息學(xué)的方法，IFN-α蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)，三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，雞十二指腸和法氏囊中都含有IFN-α基因，其編碼含有193個(gè)氨基酸殘基的IFN-α蛋白，IFN-α蛋白質(zhì)的分子式為C976H1526N296O282S8，原子總數(shù)3088，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量22175.1，理論等電點(diǎn)9.06，氨基酸總數(shù)193。在氨基酸組成上，亮氨酸Leu（L）最多，有28個(gè)，占14.5%?？偟膸ж?fù)電殘基（Asp+Glu）為14，總的帶正電殘基（Arg+Lys）為19。IFN-α蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋所占比例為39.38%，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例為52.85%。IFN-α蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由5個(gè)α螺旋緊密排列而成。

4 結(jié)論

雞十二指腸、法氏囊都有IFN-α基因的表達(dá)，其是一種主要由α螺旋排列而成的蛋白質(zhì)。

［1］ Huang JS，Yao CJ，Chuang SE，Yeh CT，Lee LM，Chen RM，Chao WJ，Whang-Peng J，Lai GM：Honokiol inhibits sphere formation and xenograft growth of oral cancer side population cells accompanied with JAK/STAT signaling pathway suppression and apoptosis induction［J］.BMC cancer，2016，16（1）：245.

［2］ Subhashini，Chauhan PS，Dash D，Paul BN，Singh R： Intranasal curcumin ameliorates airway inflammation and obstruction by regulating MAPKinase activation（p38，Erk and JNK）and prostaglandin D2 release in murine model of asthma［J］.International immunopharmacology，2016，（31）：200-206.

［3］ Yan L，Shi G：［Effect of IFN-alpha on hepatic cancer SMCC-7721 cell via PI3K/Akt signaling pathway and related mechanism research［J］. Zhonghua yi xue za zhi，2015，95（36）：2960-2963.