文/山東綠都生物科技有限公司 張文通 沈志強(qiáng)

山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 魏 鳳 李 峰 王金良 苗立中 劉吉山 沈志強(qiáng)

一例豬偽狂犬變異株的診治

文/山東綠都生物科技有限公司 張文通 沈志強(qiáng)

山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 魏 鳳 李 峰 王金良 苗立中 劉吉山 沈志強(qiáng)

為對(duì)山東省某養(yǎng)豬場(chǎng)疑似豬偽狂犬病進(jìn)行診斷，采用發(fā)病情況調(diào)查、臨床癥狀、病理剖檢、病原分離、PCR鑒定及血清中和試驗(yàn)診斷，確診病原為豬偽狂犬病毒變異株。根據(jù)確診結(jié)果，按照豬偽狂犬病治療措施操作，豬場(chǎng)發(fā)病情況得到有效控制。

豬偽狂犬變異株；診治；病原分離

豬偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的一種豬急性傳染病，以發(fā)熱、奇癢及神經(jīng)系統(tǒng)障礙為特征。成豬一般呈隱性感染；妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎；新生仔豬除出現(xiàn)發(fā)熱和神經(jīng)癥狀外，還可見嘔吐、腹瀉。該病幾乎遍布世界各地，我國(guó)絕大部分地區(qū)均有流行［1～4］。2015年12月，山東某養(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)以妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，存活仔豬（10日齡左右）出現(xiàn)大量死亡為特征的疑似豬偽狂犬病?，F(xiàn)將診斷過(guò)程介紹如下。

1 發(fā)病情況調(diào)查

2015年12月初，山東某養(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，流產(chǎn)及產(chǎn)死胎率達(dá)30%；10日齡左右仔豬出現(xiàn)抽搐、腹瀉等癥狀，發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率33%。按仔豬大腸桿菌病用抗生素治療，無(wú)效。

2 臨床癥狀

妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎?；疾∽胸i體溫為41℃左右、腹瀉、臨死前抽搐。

3 病理變化

剖檢病死仔豬：腦出血或充血，肝、脾有白色壞死點(diǎn)，肺水腫，淋巴結(jié)出血等病變。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 病料采集與處理

取病死仔豬腦組織作為病料。將采集的病料剪碎、添加3倍滅菌生理鹽水，用勻漿器研磨制成懸液；懸液反復(fù)凍融3次；低速離心取上清，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.2 病毒分離培養(yǎng)

將4.1凍存的上清，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，作為細(xì)胞接種病料；待Vero細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，按照5%比例將處理好的病料接種Vero細(xì)胞，37℃吸附1h后，換為含2% FBS的DMEM細(xì)胞維持液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變（CPE），并記錄。待85%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，將其收獲凍存，備用。如果無(wú)CPE出現(xiàn)，連續(xù)盲傳6代，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。

圖1 病毒接種細(xì)胞（左圖接種病料，右圖細(xì)胞對(duì)照）

圖2 PRV gE的PCR結(jié)果

4.3 病毒RT-PCR鑒定

4.3.1 引 物 設(shè) 計(jì) 根 據(jù)GenBank KP722022的DNA序列，利用Prime 5.0軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度約805bp的PRV gE基因。引物合成單位為生工生物工程（上海）股份有限公司。擴(kuò)增PRV gE的引物序列為：上游引物：5'-CCATGCGGCCCTTTCTGCTG-3'；下游引物：5'- TAGTACCAGTCCAGCGT GGC-3′。

4.3.2 病毒DNA基因組提取 蛋白酶K法提取病毒DNA。詳細(xì)操作方法如下：取上述4.1中-80℃凍存的上清535μL、加入10% SDS溶液60μL、再加入蛋白酶K（20mg/mL）5μL，55℃水浴1h；等體積（600μL）的酚∶氯仿（1∶1）混合物抽提，12，000rpm離心5min；取上清加入等體積的氯仿∶異丙醇（24∶1）抽提，12，000rpm離心5min；取上清加入2倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的醋酸鈉（3mol/L），混勻，-20℃沉淀30min；12，000rpm離心10min，棄上清，沉淀，室溫晾干，加入30μL的滅菌蒸餾水溶解。溶解液即為病料的DNA基因組。

4.3.3 病 毒 的PCR PCR體 系：2.5μL 10×PCR Buffer、2.0μL dNTP（10mmol/L）、0.5μL P1、0.5μL P2、0.5μL rTaq、4μL DNA、15μL滅菌水。

PCR反應(yīng)程序：94℃ 5min、94℃ 1min、60℃ 70s、72℃ 1min、35個(gè)循環(huán)后、72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠（濃度為1%）電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果與設(shè)計(jì)擴(kuò)增大小片段相符（設(shè)計(jì)片段大小為805bp）。結(jié)果見圖2。

用多功能DNA純化回收試劑盒（BioTeKe）回收PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體。送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如圖3。

將該測(cè)序產(chǎn)物翻譯成氨基酸序列，其中48位有1個(gè)天冬氨酸插入，這與趙鴻遠(yuǎn)等［4］報(bào)道豬偽狂犬變異株gE基因分子特征一致。

4.4 病毒血清中和試驗(yàn)

已知Bartha K61中和抗體效價(jià)為1∶32血清及Bartha K61毒株為山東綠都生物科技有限公司保存。按照2010年版《中國(guó)獸藥典》附錄49方法，用分離的毒株測(cè)上述已知血清抗體效價(jià)。同時(shí)用Bartha K61毒株作對(duì)照。

圖3 PRV gE的核苷酸序列

試驗(yàn)結(jié)果顯示：Bartha K61毒株能夠正確測(cè)出上述已知中和抗體效價(jià)的血清，而新分離毒株仍有病變、不能被上述血清中和。因此，相對(duì)Bartha K61毒株，新分離的豬偽狂犬毒株在抗原性上發(fā)生了變異。

5 治療

①深埋病死豬，隔離發(fā)病豬。用碘制劑消毒劑對(duì)全場(chǎng)特別是發(fā)病豬舍及四周嚴(yán)格消毒，1次/d，連續(xù)消毒1周。嚴(yán)格生物安全措施，禁止發(fā)病豬舍與健康豬舍之間的人流與物流混雜。

②全場(chǎng)所有豬群緊急接種武漢科前生物的科衛(wèi)寧（HB-98株活疫苗）+科威寧（鄂A株滅活疫苗）。其中先免科威寧（鄂A株滅活疫苗），3周再加強(qiáng)1次；間隔1個(gè)月之后免科衛(wèi)寧（HB-98株活疫苗）。免疫方法按照疫苗說(shuō)明書操作。

③對(duì)所有發(fā)病豬群飼料添加廣譜抗生素及電解多維，連用7d?？刂评^發(fā)感染。

通過(guò)采取上述措施，2個(gè)月后回訪該豬場(chǎng)，豬場(chǎng)發(fā)病情況已轉(zhuǎn)危為安。■

［1］ 單虎，李明義，沈志強(qiáng).現(xiàn)代獸醫(yī)獸藥大全［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2011：304～307.

［2］ 彭金美，安同慶，趙鴻遠(yuǎn)，等.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（1）：1～4.

［3］ 張青占.變異豬偽狂犬病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性分析［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

［4］ 趙鴻遠(yuǎn).豬偽狂犬病病毒變異株的分離鑒定及其生物學(xué)特性的研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院地科技合作引導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目 214YDHZ32；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目SDAIT-06-022-15。