張磊　付煒　張文　白潔　馮蓓　唐梓清　張海波

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞平面共培養(yǎng)促進(jìn)微血管網(wǎng)形成的初步研究

張磊付煒張文白潔馮蓓唐梓清張海波

目的研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）與內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）在不使用Matrigel等基質(zhì)，以及在含或不含血清的條件下，于普通平面培養(yǎng)皿上共培養(yǎng)的成網(wǎng)能力，為日后兩類細(xì)胞相互作用的研究提供一種外界干擾最少的共培養(yǎng)條件。方法以全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，并從培養(yǎng)形態(tài)、細(xì)胞表面標(biāo)記物和三系分化能力等方面予以鑒定。以添加或不添加10%FBS的低糖DMEM為培養(yǎng)液，將大鼠BMSCs與ECs共培養(yǎng)于普通平面培養(yǎng)皿上，連續(xù)觀察微血管網(wǎng)的形成過程，并通過CM-Dil標(biāo)記特定細(xì)胞的方法了解血管網(wǎng)中細(xì)胞構(gòu)成。平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物SM22α，Calponin及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31被用于檢測(cè)上述條件下微血管網(wǎng)中細(xì)胞標(biāo)記物變化。結(jié)果通過全骨髓貼壁培養(yǎng)可分離并獲得大鼠BMSCs。在含10%FBS條件下，細(xì)胞于普通平面培養(yǎng)皿上共培養(yǎng)8 d可形成明顯的微血管網(wǎng)，微血管網(wǎng)由大鼠BMSCs和ECs共同構(gòu)成；在無血清共培養(yǎng)條件下，大鼠BMSCs和ECs可于24 h內(nèi)共同參與形成微血管網(wǎng)。免疫熒光染色顯示CD31+細(xì)胞和SM22α+/Calponin+細(xì)胞共同構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)論在普通平面培養(yǎng)皿上，以含血清或不含血清的培養(yǎng)液共培養(yǎng)大鼠BMSCs和ECs均可形成微血管網(wǎng)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)微血管網(wǎng)

組織器官中的微小血管是保障組織正常生理代謝和養(yǎng)料供給的重要結(jié)構(gòu)。然而，體外新構(gòu)建的組織工程組織或器官，一般尚缺乏微小血管，因此體內(nèi)移植后早期的營養(yǎng)供給主要依靠周圍組織液滲透。但溶解的氧氣向組織中滲透的深度不到200μm[1]，因此對(duì)于大部分組織工程組織或器官，是否具有或能否快速形成微小血管，是其移植成功的關(guān)鍵，也一直是組織工程研究的重要課題[2]。

為了實(shí)現(xiàn)組織工程組織的血管化，提出了支架材料改造、添加促血管生成相關(guān)因子[3]、體內(nèi)預(yù)血管化[4]等方法。這些方法基于新生血管形成的基本環(huán)節(jié)，其特征是材料或組織植入后，自體滋養(yǎng)血管緩慢長入，但效率較低。近年來，于體外直接構(gòu)建組織微血管，尤其是基于血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的血管新生方法開始受到越來越多重視。作為參與新生血管形成的主要細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞可與血管平滑肌相互作用：共培養(yǎng)體系中，前者可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，并提高平滑肌中α-SMA及Calponin等標(biāo)記物的含量[5]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞與血管周細(xì)胞、脂肪基質(zhì)細(xì)胞等具有干細(xì)胞性的間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，體外可自發(fā)形成微血管網(wǎng)[6]。由于這種微血管網(wǎng)的形成被認(rèn)為是血管新生的重要過程，因此在體外實(shí)驗(yàn)中，是否觀察到這種自發(fā)形成的微血管網(wǎng)，是評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞與另一種細(xì)胞共培養(yǎng)后能否可以促進(jìn)新生血管形成的標(biāo)志[7]。

盡管自發(fā)形成的微血管網(wǎng)已被證明是共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞與其中的間充質(zhì)干細(xì)胞直接接觸后相互作用的結(jié)果，并與該過程中細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL6等細(xì)胞因子有關(guān)[8]，但隨著研究的深入，共培養(yǎng)條件對(duì)微血管網(wǎng)形成的影響受到關(guān)注。Li等[9]認(rèn)為，傳統(tǒng)的基質(zhì)膠（Matrigel）作為研究共培養(yǎng)體系中微血管形成的支持基質(zhì)是不合適的，因此他們有意識(shí)地選擇普通培養(yǎng)皿作為共培養(yǎng)載體，以排除基質(zhì)膠對(duì)其他細(xì)胞的非特異性促微血管網(wǎng)形成作用[10]。另外，作為培養(yǎng)液常用的添加物，胎牛血清（FBS）對(duì)微血管網(wǎng)形成的影響也開始受到重視[11]。但事實(shí)上，多數(shù)研究依然添加FBS，并使用含內(nèi)皮細(xì)胞支持成分的培養(yǎng)液，這都可能對(duì)研究間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的相互作用造成潛在影響。

本研究中，我們以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在普通平面培養(yǎng)皿中直接共培養(yǎng)，并以添加或不添加FBS的低糖DMEM為培養(yǎng)液，探索上述細(xì)胞在較單一的外界條件下自發(fā)形成微血管網(wǎng)的能力，為今后研究上述細(xì)胞的相互作用，提供外界作用最少的共培養(yǎng)條件。

1　材料與方法

1.1材料

體質(zhì)量（150±10）g雄性清潔級(jí)SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（Cell Application公司，cat.#R304K-05a）。

低糖DMEM培養(yǎng)液（Hyclone，美國），胎牛血清（Novogen，澳大利亞），OriCellTMSD Rat Mesenchymal Stem Cell Condrogenic Differentiation Medium、Osteogenic Differentiation Medium、Adipogenic Differentiation Medium（OriCell，美國），抗大鼠CD11b、CD29、CD31、CD44、CD45單抗（eBioscience，美國），CellTrackerTMCM-Dil（Invitrogen，美國），Anti-SM22 alpha antibody、Anti-CD31[HEC7]antibody、Calponin、Donkey Anti-Mouse IgG H&L、Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（Abcam，美國）。

1.2方法

1.2.1大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)

采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs[12]：將大鼠頸椎脫臼處死后，完全浸泡于75%乙醇，10 min后取出。在無菌條件下完整分離大鼠股骨或脛骨。取出的股骨或脛骨用低糖DMEM培養(yǎng)液清洗后，轉(zhuǎn)入10 m L含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液中。用止血鉗夾碎骨骼一端，再用10m L無菌注射器抽取培養(yǎng)液，從骨骼斷端插入，反復(fù)沖洗出骨髓。將所得的含骨髓的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱靜置恒溫培養(yǎng)。原代細(xì)胞靜置培養(yǎng)24 h后換液，換液時(shí)用PBS洗去培養(yǎng)皿底部不貼壁的細(xì)胞。以后每2天換液，細(xì)胞達(dá)到60%～70%融合時(shí)傳代。傳代后的細(xì)胞每2～3天換液，當(dāng)其達(dá)到70%融合后再傳代。第3代大鼠BMSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2大鼠BMSCs的鑒定

由于大鼠BMSCs在不同的培養(yǎng)階段具有特定的細(xì)胞形態(tài)，因此原代和傳代后的大鼠BMSCs可通過倒置相差顯微鏡觀察，予以形態(tài)學(xué)方面的鑒別。為了解分離培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)記物，第3代大鼠BMSCs用胰酶消化后重懸于200μL PBS，根據(jù)試劑操作說明，分別加入抗大鼠CD11b、CD29、CD31、CD44和CD45單抗[13]，于4℃條件下避光孵育30min。標(biāo)記細(xì)胞用PBS洗滌后，通過流式細(xì)胞儀對(duì)其表面標(biāo)記物予以鑒定[14-15]。未標(biāo)記的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。為了驗(yàn)證上述獲得的大鼠BMSCs具有三系分化能力，我們按照OriCellTMSD Rat Mesenchymal Stem Cell Condrogenic Differentiation Medium、Osteogenic Differentiation Medium和Adipogenic Differentiation Medium說明書的指導(dǎo)方案，分別誘導(dǎo)其成骨、成脂肪和成軟骨，并完成特殊染色。

1.2.3大鼠BMSCs和ECs的共培養(yǎng)

根據(jù)我們預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和類似文獻(xiàn)的報(bào)道，我們將大鼠BMSCs和ECs按照4.0×104cells/cm2和1.3×104cells/cm2的密度種植于6孔板，以含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的低糖DMEM為培養(yǎng)液，分別于共培養(yǎng)24 h、48 h、4 d和8 d動(dòng)態(tài)觀察微血管網(wǎng)的形成情況。為了進(jìn)一步觀察兩種細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件時(shí)的成網(wǎng)能力，以相同的實(shí)驗(yàn)方法，將細(xì)胞培養(yǎng)于僅添加有1%青霉素/鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)觀察。

1.2.4微血管網(wǎng)的細(xì)胞來源構(gòu)成

為了解何種細(xì)胞參與構(gòu)成了微血管網(wǎng)，實(shí)驗(yàn)中將其中一種細(xì)胞標(biāo)記紅色熒光，再按照上述有血清條件下共培養(yǎng)的方法培養(yǎng)8 d，最后通過熒光顯微鏡觀察，標(biāo)記有紅色熒光的細(xì)胞在微血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)中的定位。具體方法是，以PBS重懸待染色的細(xì)胞至1.0×106cells/mL，每毫升細(xì)胞液加入5μL CM-Dil染液。將標(biāo)記的細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱孵育5 min后，再轉(zhuǎn)移至4℃冰箱孵育15 min，完成細(xì)胞熒光標(biāo)記。處理后的細(xì)胞用PBS洗滌2次。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將標(biāo)記有CM-Dil的大鼠BMSCs與未標(biāo)記的ECs，或標(biāo)記有CM-Dil的ECs和未標(biāo)記的大鼠BMSCs按上述已確定的比例混合，并以含10%FBS培養(yǎng)液共培養(yǎng)，8 d后用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記細(xì)胞的分布。將標(biāo)記有CM-Dil的ECs和未標(biāo)記的大鼠BMSCs共培養(yǎng)于無血清低糖DMEM培養(yǎng)液，24 h后用熒光顯微鏡觀察帶熒光細(xì)胞與未帶熒光細(xì)胞間的定位關(guān)系。1.2.5共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞分化

為了解共培養(yǎng)體系中大鼠BMSCs的表型變化，我們以相同的種植密度，將大鼠BMSCs和ECs共培養(yǎng)于24孔板中，以含10%FBS的培養(yǎng)液共培養(yǎng)8 d后固定，完成免疫熒光染色。在無血清培養(yǎng)條件下，共培養(yǎng)24 h后，完成免疫熒光染色。實(shí)驗(yàn)中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31被標(biāo)記為紅色，平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物calponin或SM22α標(biāo)記為綠色；最后用DAPI套染細(xì)胞核。

2　結(jié)果

2.1大鼠BMSCs的培養(yǎng)

原代細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3 d后，倒置相差顯微鏡下可見貼壁細(xì)胞呈棒狀或紡錘狀，細(xì)胞聚集呈克隆樣生長（圖1A）。培養(yǎng)至第7天時(shí)，細(xì)胞克隆變大，細(xì)胞增多（圖1B）。細(xì)胞傳代后，細(xì)胞分散生長，呈長梭形（圖1C）。

2.2大鼠BMSCs的細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)和三系分化能力鑒定

以流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)第3代大鼠BMSCs的幾種表面標(biāo)記物予以鑒定。結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的細(xì)胞CD11b、CD31、CD45呈陰性，CD29、CD44為陽性（圖2A）。我們還進(jìn)一步檢測(cè)了該大鼠BMSCs的三系分化能力。細(xì)胞成脂誘導(dǎo)4周后，可見細(xì)胞中出現(xiàn)大小不一具有強(qiáng)折光性、且能被油紅O染為紅色的脂滴。細(xì)胞成骨誘導(dǎo)3周，可見由茜素紅S染為紅色的鈣鹽沉積。細(xì)胞軟骨誘導(dǎo)4周可形成堅(jiān)實(shí)的軟骨球，通過免疫組化染色，可見棕色染色的Ⅱ型膠原，證明有軟骨細(xì)胞生成（圖2B-D）。通過上述細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)記物、三系分化能力等方面的鑒定，我們認(rèn)為，通過大鼠全骨髓貼壁法可獲得較純的大鼠BMSCs。2.3大鼠BMSCs和ECs普通平面培養(yǎng)皿上共培養(yǎng)

將兩種細(xì)胞按既定的比例混合，以含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液，在普通平面培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，第4天可見共培養(yǎng)體系中部分細(xì)胞開始聚集成條索網(wǎng)狀，到共培養(yǎng)第8天，條索中聚集的細(xì)胞增多，相互間開始連接成網(wǎng)，表明微血管網(wǎng)形成，且明顯高出周圍的細(xì)胞（圖3A-D）。相同條件下，單獨(dú)培養(yǎng)的ECs或大鼠BMSCs在整個(gè)過程中僅表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量增多，長滿培養(yǎng)皿，未見條索樣微血管網(wǎng)形成（圖3E-F）。

2.4大鼠BMSCs和ECs平面共培養(yǎng)后的細(xì)胞表型變化

為了解共培養(yǎng)微血管網(wǎng)形成后的細(xì)胞表型變化，我們通過免疫熒光染色對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31、平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物SM22α和Calponin進(jìn)行染色。單獨(dú)培養(yǎng)于含血清培養(yǎng)液中的內(nèi)皮細(xì)胞，其CD31+，SM22α-和Calponin-；而單獨(dú)培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs基本不表達(dá)SM22α及Calponin。上述兩種細(xì)胞在含血清培養(yǎng)液中共培養(yǎng)8 d后，可見微血管網(wǎng)形成。免疫熒光染色顯示，血管網(wǎng)條索中存在CD31+細(xì)胞（圖4A）；同時(shí)出現(xiàn)大量SM22α+及Calponin+細(xì)胞。這些具有平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞，大部分位于微血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上（圖4B-C），表明微血管出現(xiàn)的同時(shí)，其構(gòu)成細(xì)胞向平滑肌發(fā)生分化，分化的細(xì)胞聚集構(gòu)成微血管網(wǎng)。

2.5微血管網(wǎng)的細(xì)胞來源構(gòu)成

為了解共培養(yǎng)體系中微血管網(wǎng)的細(xì)胞構(gòu)成來源，我們首先用CM-Dil活細(xì)胞染料將大鼠BMSCs標(biāo)記紅色熒光，再與未標(biāo)記的ECs共培養(yǎng)。共培養(yǎng)第8天，微血管網(wǎng)形成，熒光顯微鏡觀察見微血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)中紅色熒光標(biāo)記的大鼠BMSCs（圖5A-C）。我們將ECs單獨(dú)用CM-Dil標(biāo)記紅色熒光，并與未標(biāo)記的大鼠BMSCs共培養(yǎng)。在第8天可見明顯的微血管網(wǎng)形成，且有ECs標(biāo)記的紅色熒光（圖5D-F）。上述現(xiàn)象說明，有血清平面共培養(yǎng)條件下，微血管網(wǎng)主要由大鼠BMSCs和ECs共同構(gòu)成。

2.6無血清及平面共培養(yǎng)下微血管網(wǎng)的自發(fā)形成

無血清條件下共培養(yǎng)可以排除動(dòng)物血清成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。因此，我們進(jìn)一步將上述兩種細(xì)胞在無血清低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)17 h后細(xì)胞即可相互連接，構(gòu)成明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖6A）。對(duì)照組中，單獨(dú)培養(yǎng)的ECs或大鼠BMSCs在無血清培養(yǎng)液中無法形成類似的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖6B-C）。用CM-Dil標(biāo)記ECs，與未標(biāo)記的大鼠BMSCs共培養(yǎng)后，還可以觀察到帶紅色熒光的ECs及不帶熒光的大鼠BMSCs共同參與形成微血管網(wǎng)（圖6 D-F）。與有血清條件共培養(yǎng)不同的是，無血清條件下形成的微血管網(wǎng)于3 d內(nèi)迅速消失，不能長期維持。免疫熒光染色結(jié)果顯示，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31+細(xì)胞與平滑肌標(biāo)記物SM22α+或Calponin+細(xì)胞共同構(gòu)成微血管網(wǎng)（圖6G-H）。上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說明，兩種細(xì)胞在無血清條件下于平面培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)依然可以自發(fā)形成微血管網(wǎng)。

圖1　不同培養(yǎng)時(shí)期大鼠BMSCs的形態(tài)（標(biāo)尺：100μm）Fig.1 Them orphology of the culturing rat bonem ar row stem cells(BM SCs).(Scale bar:100μm)

圖2　大鼠BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物和三系分化鑒定（標(biāo)尺：100μm）Fig.2 Cell surface phenotypes and trilineage differentiation of rat bonem arrow stem cells(BMSCs)(Scale bar:100μm)

圖3　大鼠BMSCs和ECs在普通平面培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)（標(biāo)尺：A-C 100μm；D-F 200μm）Fig.3 Rat bonem arrow stem cells(BMSCs)and endothelial cells(ECs)co-cultured on two-dim ensional p lastic tissue cu lture p late (Scale bars:A-C 100μm;D-F 200μm)

圖4　在含10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)條件下，平面培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)8 d后，共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞表型鑒定（標(biāo)尺：100μm）Fig.4 Imm unofluorescent stain ing of cellm arker of the vascular network form ed 8 days after co-cultured in m ed ium containing 10%FBS.(Scale bar:100μm)

圖5　有血清平面共培養(yǎng)條件下微血管網(wǎng)的細(xì)胞構(gòu)成（標(biāo)尺：100μm）Fig.5 Cell constitu tion of the vascular network from rat bonemarrow stem cells(rBMSCs)and endothelial cells(ECs)co-cultured on p lastic tissue culture p late.(Scale bars:100μm)

圖6　無血清平面共培養(yǎng)條件下的微血管網(wǎng)的形成和細(xì)胞構(gòu)成（標(biāo)尺：100μm）Fig.6 Vascular network form ation and cell constitution in serum-free co-culture condition on p lastic two-dim ensional tissue culture p late(Scale bars:100μm)

3　討論

BMSCs是一類來源于骨髓，具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞。由于其容易獲取與培養(yǎng)擴(kuò)增，因此廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)中，我們首先通過形態(tài)觀察，確認(rèn)抽取培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞具有BMSCs的一般特征。根據(jù)Li等[12]的描述，原代培養(yǎng)24 h的BMSCs呈棒狀或紡錘狀，并逐漸于原代培養(yǎng)第1～5天形成大小不一的細(xì)胞克隆。這與我們分離培養(yǎng)的原代骨髓細(xì)胞的生長形態(tài)一致。傳代后的骨髓細(xì)胞在融合后呈螺旋狀排列，也符合典型的BMSCs形態(tài)描述[12]。針對(duì)BMSCs表面標(biāo)記物，我們獲取的骨髓細(xì)胞CD11b、CD31、CD45呈陰性，CD29、CD44為陽性，符合文獻(xiàn)中BMSCs的一般特征[13]。而三系分化實(shí)驗(yàn)還證明了該骨髓細(xì)胞具有成骨、成軟骨和成脂肪潛能。因此可以認(rèn)為，我們通過全骨髓貼壁分離培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞是BMSCs。

盡管MSC與ECs相互作用可促進(jìn)微血管網(wǎng)形成，但培養(yǎng)條件及外源物質(zhì)干擾對(duì)共培養(yǎng)體系的潛在影響尚未獲得普遍重視。已知內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于基質(zhì)膠中可自發(fā)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此，基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)被廣泛用于鑒定內(nèi)皮細(xì)胞或評(píng)價(jià)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化[16]。由于所用的基質(zhì)膠（Matrigel）來源于Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，其來源情況復(fù)雜，因此基于基質(zhì)膠的實(shí)驗(yàn)依然存在諸多影響結(jié)果的不確定因素：一方面，在基質(zhì)膠中成網(wǎng)并不是內(nèi)皮細(xì)胞才具有的特征[10]，將含MSC細(xì)胞團(tuán)的基質(zhì)膠移植到裸鼠皮下后，MSC可向內(nèi)皮細(xì)胞分化[17]；另一方面，不同生產(chǎn)來源的基質(zhì)膠對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用也不盡相同，甚至產(chǎn)生截然不同的結(jié)果[18]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了以普通培養(yǎng)皿平面條件下共培養(yǎng)的方法。這是研究細(xì)胞間相互作用最直接的方法，同時(shí)也避免了基質(zhì)膠引起的不確定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，平面培養(yǎng)皿中的BMSCs和ECs，在含10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)8 d，即可明顯聚集成由BMSCs與ECs共同組成的微血管網(wǎng)。這與Merfeld-Clauss等[11，19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。他們將ECs與脂肪間充質(zhì)細(xì)胞在二維條件下共培養(yǎng)6 d后可見明顯的微血管網(wǎng)。

無血清培養(yǎng)從培養(yǎng)液層面杜絕了血清中復(fù)雜成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能造成的影響。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可于無血清MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)2～4周，且不影響其增殖和分化能力[20]。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)想將BMSCs和ECs在平面共培養(yǎng)于單純DMEM培養(yǎng)液中，以探索無血清DMEM作為培養(yǎng)液時(shí)是否仍能形成微血管網(wǎng)。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)的細(xì)胞依然可以相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，然而與含血清培養(yǎng)液共培養(yǎng)條件下形成的細(xì)胞網(wǎng)不同，無血清條件下微血管網(wǎng)形成的時(shí)間更短（24 h以內(nèi)）、參與形成微血管網(wǎng)的細(xì)胞更少、穩(wěn)定維持的時(shí)間變短（＜3 d）。但可以確定的是，微血管網(wǎng)依然由BMSCs與ECs共同形成。

在不同的共培養(yǎng)條件及時(shí)間下，共培養(yǎng)體系中自發(fā)形成的微血管網(wǎng)的特征不同?？偨Y(jié)文獻(xiàn)報(bào)道中的網(wǎng)絡(luò)形態(tài)，在培養(yǎng)皿中二維共培養(yǎng)的細(xì)胞，在共培養(yǎng)24 h內(nèi)形成者，微血管網(wǎng)條索細(xì)，由單細(xì)胞相互連接形成[9]。而長時(shí)間（如1周左右）共培養(yǎng)下形成的微血管網(wǎng)條索中則聚集有大量細(xì)胞，因而粗大，且可以觀察到中間包圍的未被募集的平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物陰性的細(xì)胞[11]。這與我們實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的兩類微血管網(wǎng)形態(tài)一致。

共培養(yǎng)細(xì)胞的直接接觸是間充質(zhì)干細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)形成的必要條件[19]。在其形成過程中，還會(huì)發(fā)生細(xì)胞表型變化。我們的實(shí)驗(yàn)中，隨微血管網(wǎng)出現(xiàn)的還有參與其構(gòu)成的SM22α+和Calponin+細(xì)胞，且該細(xì)胞的出現(xiàn)與培養(yǎng)液條件無關(guān)。既往的研究將臍血間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel中培養(yǎng)，可觀察到共培養(yǎng)體系細(xì)胞中SM22、SMA這類平滑肌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)增高[21]。有研究指出，間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞接觸共培養(yǎng)后，間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)TGF-β表達(dá)上調(diào)。Hirschi等將具有多能性10T1/2細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)前者可新表達(dá)SM22α與Calponin等平滑肌標(biāo)記物。這與TGFβ誘導(dǎo)10T1/2細(xì)胞表達(dá)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)果類似；而中和共培養(yǎng)體系中的TGFβ則可阻斷平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)[22]，并阻斷這兩種細(xì)胞在Matrigel共培養(yǎng)體系中微血管網(wǎng)的形成[23]。Lin等[24]通過在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入TGFβ1受體阻斷劑后，不僅微血管網(wǎng)形成明顯受到抑制，還可下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、VE-cadherin等因子的表達(dá)。另外，間充質(zhì)干細(xì)胞還可被VEGF誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞[25]。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為，大鼠BMSCs與ECs在普通平面培養(yǎng)皿中，以添加或不添加10% FBS的低糖DMEM為培養(yǎng)液共培養(yǎng)，可以觀察到明顯的自發(fā)微血管網(wǎng)形成。這說明上述條件可以作為研究這兩種細(xì)胞相互作用的“最低條件”，以獲得最直接和準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但我們的實(shí)驗(yàn)也還存在不足，比如尚未觀察到共培養(yǎng)體系中細(xì)胞趨化遷移的過程，也不能明確證明共培養(yǎng)后CD31+，SM22α+或Calponin+細(xì)胞來源于何種細(xì)胞，以及共培養(yǎng)前后的定量關(guān)系。這些問題還將在今后的研究中逐步完善。

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Two-D imensional Co-Culture of Bone M arrow Mesenchymal Stem Cells and Endothelial Cells for Inducing the Self-Assemb led Vascular Network

ZHANG Lei1,FU Wei1,2,ZHANG Wen1,BAI Jie1,2,FENG Bei1,2,TANG Ziqing1, ZHANG Haibo1.1 Department of Pediatric Cardiothoracic Surgery;2 Institute of Pediatric Translational Medicine,Shanghai Children's Medical Center,School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai200127,China.Corresponding author: ZHANGHaibo(E-mail:haibo.z@yahoo.com).

Objective To observe the vascular network formation by co-culturing rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)and endothelial cells(ECs)under conditions of two-dimensional co-culturing with/without serum,which would provide a minimum basal co-culture condition for the further study of the interactions between the cells.M ethods Rat BMSCs were isolated by direct adherence of the whole bonemarrow,and were identified by cellmorphology,cell surface antigens and three-lineage differentiation.Low-glucose DMEM with/without 10%FBSwas used during the co-culture of rat BMSCs and ECs,followed by a consecutive observation of the vascular network formation.CM-Dil solely labeled rat BMSCs or ECs were then co-cultured to verify the cell type within the network.Finally,immunofluorescent staining of EC marker CD31 and smoothmuscle cellmarker SM22αand Calponin was used to identify the cell differentiation during the co-culture. Resu lts Whole marrow direct adherence was used to isolate rat BMSCs successfully.With medium containing 10%FBS, co-cultured cells assembled vascular network in 8 days,which was formed together by rat BMSCs and ECs.In serum-free medium,however,self-assembled vascular network was formed together by co-cultured cells within 24 hours.In both settings,CD31+cells and SM22αor Calponin weremostly seen in the network structure.Conclusion Rat BMSCs and ECscan be co-cultured on two-dimensional plateswith/without serum-containingmedium for the induction of the self-assembled vascular network.

Bonemarrow mesenchymal stem cell;Endothelial cell;Co-culture;Vascular network

Q813.1+2

A

1673－0364（2016）05－0269－08

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.05.001

國家自然科學(xué)基金（31200735）；上海市科委基金（134119a0400，15411966800）；上海衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目（20144Y0166）；東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金。

200127上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心心胸外科（張磊，付煒，張文，白潔，馮蓓，唐梓清，張海波）；兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所（付煒，白潔，馮蓓）。

張海波（E-mail：haibo.z@yahoo.com）。

（2016年8月14日；

2016年9月27日）