張晶波，王敬輝，崔京輝，于霞麗,陳 萌

(1 北京市西城區(qū)疾病預(yù)防控制中心,北京 100120； 2 北京市疾病預(yù)防控制中心,北京 100013)

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·論著·

2014年北京市西城區(qū)40例麻疹患者分離的麻疹病毒基因型及同源性

張晶波1，王敬輝1，崔京輝1，于霞麗2,陳 萌2

(1 北京市西城區(qū)疾病預(yù)防控制中心,北京 100120； 2 北京市疾病預(yù)防控制中心,北京 100013)

目的 了解北京市某城區(qū)2014年分離的麻疹病毒基因型，及時(shí)發(fā)現(xiàn)輸入性麻疹病例。方法 采用熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，對(duì)北京市西城區(qū)2014年采集的標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸鑒定、RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及序列比對(duì)分析。結(jié)果 2014年北京市西城區(qū)共采集81例麻疹疑似患者的82份標(biāo)本，其中咽拭子63份，尿19份。麻疹病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性70例，RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序獲得基因序列40份，麻疹病毒培養(yǎng)陽(yáng)性毒株37例。種系進(jìn)化樹分析顯示，獲得的40份麻疹病毒基因序列與H基因簇代表株Chin9322/H1a，以及世界衛(wèi)生組織推薦的代表株MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1在同一分支上，核苷酸水平上同源性分別為98%～98.9%、96.9%～97.8%；氨基酸水平上同源性分別為97.3%～99.3%、95.3%～98%。結(jié)論 2014年北京市西城區(qū)麻疹病例以本土基因型(H1)病例為主，進(jìn)一步加強(qiáng)麻疹病例病原學(xué)監(jiān)測(cè)對(duì)麻疹輸入性病例的控制和預(yù)防具有重要意義。

麻疹病毒； 核酸檢測(cè)； H1基因型； 流行病學(xué)

[Chin J Infect Control，2016，15(10)：780-784]

麻疹是由麻疹病毒感染引起的一種急性傳染病，以發(fā)熱、出疹和呼吸道卡他癥狀為主要臨床表現(xiàn)。麻疹病毒屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，只有一個(gè)血清型。病毒基因組由6個(gè)結(jié)構(gòu)基因和2個(gè)非結(jié)構(gòu)基因組成，分別編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。麻疹病毒N基因羧基末端450個(gè)核苷酸基因是最大變異區(qū)，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其序列作為劃分病毒基因型別的依據(jù)。根據(jù)WHO的建議，麻疹病毒被劃分為A～H共八個(gè)基因組23個(gè)基因型，其中B1、D1、E、F、G1基因型已消失，目前只有18個(gè)基因型在世界各地人群中流行。北京市西城區(qū)于2013年3月發(fā)現(xiàn)了首例輸入性麻疹病毒D8基因型病例，之后在其他區(qū)相繼出現(xiàn)多起該基因型引起的麻疹疫情。開展麻疹病毒分子生物學(xué)監(jiān)測(cè),明確麻疹野病毒的型別與來源,及時(shí)發(fā)現(xiàn)輸入性病例對(duì)麻疹的控制及消除具有重要的意義[1-3]。為進(jìn)一步了解北京市西城區(qū)麻疹病毒基因特征，我們對(duì)2014年麻疹監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 咽拭子或尿，由北京市西城區(qū)疾病預(yù)防控制中心計(jì)劃免疫科、轄區(qū)保健科及轄區(qū)醫(yī)院采集提供，2014年共計(jì)采集疫情及監(jiān)測(cè)患者81例82份標(biāo)本，其中咽拭子63份，尿19份。

1.2 標(biāo)本的分裝處理 實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本4°C保存或-70°C以下保存，標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行處理，避免反復(fù)凍融。將原始標(biāo)本分為三份，一份用于核酸檢測(cè)，一份用于病毒分離，一份保存待復(fù)核。72 h內(nèi)完成標(biāo)本定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)核酸鑒定,麻疹陽(yáng)性標(biāo)本做RT-PCR麻疹病毒基因片段擴(kuò)增。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.3.1 核酸提取 采用美國(guó)ABI公司核酸提取試劑盒MagMaxTM-96 Viral Isolation Kit提取核酸。

1.3.2 基因分型引物 引物序列使用美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)麻疹基因定型引物擴(kuò)增N基因COOH末端的634個(gè)核苷酸片段,引物序列為:上游引物MeV216(5′-TGG AGCTATGCCATGGGAGT-3′)，下游引物MeV214(5′-TAACAATGATGGAGGGTAGG-3′)。

1.3.3 儀器 CLASSⅡ生物安全柜為新加坡ESCO公司生產(chǎn)，低溫離心機(jī)為SIGEMA 3K15(SIGEMA公司出品)，全自動(dòng)核酸提取儀MagMaxTMExpress及定量PCR儀7500 Fast Real-time PCR System(ABI公司出品)，PCR擴(kuò)增儀iCycler伯樂公司出品。

1.3.4 核酸檢測(cè)試劑盒 麻疹風(fēng)疹雙通道real-time PCR試劑盒由江蘇和創(chuàng)公司生產(chǎn)，麻疹基因片段擴(kuò)增采用InvitrogenTMOne-Step RT-PCR Kit(美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn))。具體操作、反應(yīng)條件和結(jié)果判定見試劑盒說明書。

1.4 麻疹病毒基因片段擴(kuò)增方法 采用一步法RT-PCR, 擴(kuò)增麻疹N基因片斷。反應(yīng)參數(shù):逆轉(zhuǎn)錄階段：42 °C，10 min；預(yù)變性階段：94 °C，10 s；預(yù)擴(kuò)增階段：變性 94 °C，5 s；退火50 °C，20 s；延伸72 °C，20 s；共5個(gè)循環(huán)：變性 94°C，5 s；退火56 °C，50 s；延伸72 °C，15 s；共40個(gè)循環(huán)。PCR完成后, 用1.7%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果, 擴(kuò)增片段為634 bp。PCR產(chǎn)物送至北京市疾病預(yù)防控制中心,統(tǒng)一送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定,然后由北京市疾病預(yù)防控制中心反饋結(jié)果。

1.5 序列分析 摘錄GenBank中收錄的WHO推薦的麻疹病毒代表株、中國(guó)疫苗株及H基因簇代表株的序列，進(jìn)行核苷酸和氨基酸的相似性和差異比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。麻疹病毒基因變化最大的區(qū)域是N基因羧基端的450個(gè)核苷酸，選取450 bp進(jìn)行序列分析，應(yīng)用BioEdit 6.0及Mega 6軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 麻疹病毒核酸檢測(cè)結(jié)果及病例相關(guān)情況 2014年共采集麻疹疑似患者81例的82份標(biāo)本，麻疹病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性70例,RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序獲得基因序列40份，麻疹病毒培養(yǎng)陽(yáng)性毒株37例。獲得麻疹病毒基因序列的40例患者主要集中在3～5月，以成人(19～55歲)居多，共23例(57.5%)，<1歲患兒(4個(gè)月～1歲)共15例(37.5%)。僅2例有疫苗接種史，其余均為不詳或無；女性22例，男性18例；均為本市病例。其中11例患者采集了血標(biāo)本，9例為麻疹血IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性。見表1。

2.2 麻疹病毒基因型進(jìn)化樹分析 對(duì)40份麻疹病毒基因序列進(jìn)行分析，與WHO推薦的代表株、中國(guó)疫苗株及H基因簇代表株核酸種系進(jìn)行比對(duì)，種系進(jìn)化樹顯示,本研究40份序列與H基因簇代表株Chin9322/H1a和WHO推薦的代表株MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1在同一分支上。根據(jù)WHO對(duì)麻疹病毒基因型別劃分的規(guī)定，西城區(qū)獲得的麻疹病毒基因序列均為H1基因型，進(jìn)一步分型為H1a基因型。見圖1。

表1 2014年北京市西城區(qū)40例獲得基因序列的麻疹患者基本情況

圖1 2014年北京市西城區(qū)40份麻疹病毒基因序列進(jìn)化樹分析

2.3 核苷酸和氨基酸變異情況 將40份麻疹病毒基因序列與Chin9322/H1a，以及WHO推薦的代表株MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1的核苷酸和氨基酸同源性進(jìn)行對(duì)比分析，核苷酸水平上同源性分別為98%～98.9%和96.9%～97.8%；氨基酸水平上同源性分別為97.3%～99.3%和95.3%～98%。見表2。

表2 2014年北京市西城區(qū)40例麻疹病毒基因序列與參考株序列的核苷酸和氨基酸同源性比對(duì)

Table 2 Comparison of nucleotide and amino acid homology between 40 cases of measles virus gene sequences and reference strain sequences, Beijingin Xicheng District, 2014

序號(hào)樣本標(biāo)號(hào)核苷酸Chin9322/H1aHunan.CHN/0.93/7/H1氨基酸Chin9322/H1aHunan.CHN/0.93/7/H11Beijing14-002-XCM398.497.397.3962Beijing14-005-XCM49896.99896.73Beijing14-021-XCM698.497.396.795.34Beijing14-135-XCM1598.797.699.3985Beijing14-136-XCM1698.797.699.3986Beijing14-137-XCM1798.797.697.3967Beijing14-138-XCM1898.797.697.3968Beijing14-148-XCM2198.797.699.3989Beijing14-149-XCM2398.797.699.39810Beijing14-150-XCM2498.497.397.39611Beijing14-151-XCM2598.497.397.39612Beijing14-213-XCM2798.797.697.39613Beijing14-214-XCM2898.497.398.797.314Beijing14-231-XCM2998.797.699.39815Beijing14-232-XCM3098.997.899.39816Beijing14-233-XCM3198.797.697.39617Beijing14-289-XCM2298.997.899.39818Beijing14-291-XCM3898.797.699.39819Beijing14-292-XCM3298.797.697.39620Beijing14-293-XCM3398.797.699.39821Beijing14-294-XCM3598.997.899.39822Beijing14-507-XCM4698.497.397.39623Beijing14-508-XCM4898.997.899.39824Beijing14-572-XCM5098.997.899.39825Beijing14-573-XCM5198.797.699.39826Beijing14-574-XCM5298.997.899.39827Beijing14-575-XCM5398.797.699.39828Beijing14-576-XCM5498.497.397.39629Beijing14-577-XCM5598.497.397.39630Beijing14-578-XCM5698.997.899.39831Beijing14-630-XCM4098.997.899.39832Beijing14-825-XCM6398.297.196.795.333Beijing14-935-XCM298.797.699.39834Beijing14-936-XCM7198.797.699.39835Beijing14-937-XCM7298.797.699.39836Beijing14-938-XCM7398.797.699.39837Beijing14-1044-XCM7598.997.899.39838Beijing14-1047-XCM7798.497.399.39839Beijing14-1234-XCM7898.997.899.39840Beijing14-1239-XCM8198.797.699.398

3 討論

麻疹是一種全球廣泛傳播的病毒性傳染病，是導(dǎo)致兒童死亡最多而疫苗可以預(yù)防的疾病，也是WHO擬消除的疾病之一。2006年我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布了《2006—2012年全國(guó)消除麻疹行動(dòng)計(jì)劃》，我國(guó)麻疹發(fā)病率大幅下降，2010年又進(jìn)行了全國(guó)強(qiáng)化免疫，從2010年的2.86/10萬下降至2012年的0.46/10萬，達(dá)到有記錄以來的最低水平。但是2013年又出現(xiàn)了反彈，分離的麻疹病毒達(dá)到歷史最高水平，輸入性麻疹病毒基因型有所增加。目前，世界上有18個(gè)麻疹病毒基因型流行，中國(guó)流行的麻疹病毒本土基因型為H1基因型，2009年開始陸續(xù)出現(xiàn)輸入性病例，先后監(jiān)測(cè)到D9、D4、D11等基因型[2,4-8]。1993—2013年中國(guó)麻疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)病毒學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，5 163株麻疹病毒，5 013株為H1a型，其他基因型按照數(shù)量依次為D9、D8、A、D11、B3、H2和D4，說明我國(guó)麻疹病毒基因型以H1a型為本土優(yōu)勢(shì)基因型，其他基因型散在存在[8]。北京市1999—2008年麻疹監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，除1例D9基因型外，其余麻疹病毒均為H1基因型，說明北京市流行的麻疹病毒基因型與全國(guó)一致。2013年北京市加強(qiáng)了麻疹病例病原學(xué)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了輸入性D8、D9基因型麻疹病毒病例，除5例為D8基因型外，西城區(qū)其他麻疹病例均為H1基因型[3，9-12]。

為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)西城區(qū)麻疹病例的病毒基因型，我們對(duì)2014年北京市西城區(qū)獲得的40份麻疹病毒基因片段進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示均為H1基因型H1a基因亞型，與北京市、江蘇省、遼寧及全國(guó)的優(yōu)勢(shì)本土毒株基因型一致[8，10,13-14]。40份麻疹病毒基因序列與Chin9322/H1a，以及WHO推薦的代表株MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1的核苷酸和氨基酸同源性進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)在核苷酸水平上其同源性分別為98%～98.9%、96.9%～97.8%，在氨基酸水平上其同源性分別為97.3%～99.3%和95.3%～98%，說明西城區(qū)流行的麻疹病毒相對(duì)保守，變異不大。40例獲得基因序列的麻疹患者均為本市病例，以成人居多，一歲以下兒童次之，與北京市麻疹流行病學(xué)特征一致[15]。兒童是麻疹的易感人群，但疫苗接種初次為8個(gè)月，因此，小月齡兒童發(fā)病率高與未接種疫苗和疫苗接種時(shí)間有關(guān)；成人發(fā)病率高也與疫苗接種有關(guān)，免疫空白使得成人成為麻疹的易感人群。

由于北京市西城區(qū)監(jiān)測(cè)范圍小，病例少，數(shù)據(jù)有限，不具有北京市的代表性，但本轄區(qū)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)及時(shí)有效，2013年西城區(qū)發(fā)現(xiàn)了北京市首例輸入性麻疹病毒D8基因型病例，對(duì)北京市的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)具有預(yù)警作用[3]。我國(guó)已進(jìn)入加速消除麻疹階段，對(duì)麻疹的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)提出了新要求，加強(qiáng)麻疹病例病毒基因型監(jiān)測(cè)，不僅可以發(fā)現(xiàn)輸入性病例，也可提高該病病毒本土基因型的檢出率。通過分子流行病學(xué)溯源，嚴(yán)密監(jiān)測(cè)麻疹發(fā)病和病毒基因型特征變化，及時(shí)發(fā)現(xiàn)麻疹病毒的流行趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)輸入性病例，可以有效控制麻疹疫情蔓延，為消除麻疹提供病毒基因水平的證據(jù)。疫苗接種是消除麻疹的關(guān)鍵，成人的免疫空白導(dǎo)致成人發(fā)病率高，此部分人群逐年累積,很容易引起麻疹暴發(fā)，提示有效地控制成年人麻疹病例的發(fā)生,在人口較集中的區(qū)域進(jìn)行針對(duì)性麻疹疫苗的免疫接種，對(duì)麻疹防控具有重要的指導(dǎo)意義。

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(本文編輯：左雙燕)

Genotypes and homology of measles virus isolated from 40 patients with measles in Beijing Xicheng District in 2014

ZHANGJing-bo1,WANGJing-hui1,CUIJing-hui1,YUXia-li2,CHENMeng2

(XichengDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100120,China; 2BeijingCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100013,China)

Objective To understand the genotypes of measles virus isolated from patients with measles in Beijing Xicheng District in 2014, and timely find out imported measles cases. Methods Measles virus nucleic acid was identified with fluorescent polymerase chain reaction (PCR), then amplified by real-time PCR (RT-PCR), amplified products were sequenced and analyzed. Results 82 specimens from 81 suspected measles patients in Beijing Xicheng District in 2014 were taken, 63 were throat swab specimens and 19 were urine specimens. 70 cases were positive for measles virus nucleic acid, 40 of which were obtained gene sequence through sequencing, 37 were positive culture for measles virus. The phylogenetic tree analysis showed that gene sequences of 40 measles virus isolates were belonged to the same branch as H genotype representative strain Chin9322/H1a and MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1 recommended by World Health Organization. The homology of nucleotide were 98%-98.9% and 96.9%-97.8% respectively, homology of amino acid were 97.3%-99.3% and 95.3%-98% respectively. Conclusion The main genotype of measles cases in Beijing Xicheng District in 2014 was the local genotype (H1), surveillance of measles cases should be strengthened further to control and prevent the imported measles cases.

measles virus; nucleic acid detection; genotype H1;epidemiology

2015-12-14

張晶波( 1970-),女(漢族)，吉林省白城市人，主任技師, 主要從事微生物檢驗(yàn)研究。

張晶波 E-mail：jingbo7099@hotmail.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.10.015

R373.1+1

A

1671-9638(2016)10-0780-05