余煉 何小周 王琬玓 馮霞 徐柯 曾毅

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院病毒與藥理室(余煉、曾毅)；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(何小周、王琬玓、馮霞、曾毅、徐柯)

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·論著·

重組腺病毒載體HIV-1 env疫苗合用佐劑的免疫效果研究

余煉 何小周 王琬玓 馮霞 徐柯 曾毅

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院病毒與藥理室(余煉、曾毅)；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(何小周、王琬玓、馮霞、曾毅、徐柯)

目的 探討添加IL-7、IL-21基因佐劑及Poly(I:C)、CpG ODN對(duì)艾滋病疫苗的免疫效果有無(wú)增強(qiáng)作用。方法 構(gòu)建了表達(dá)IL-7、IL-21基因的質(zhì)粒pVR-IL7、pVR-IL21，以DNA疫苗(pVR-HIVenv)對(duì)小鼠進(jìn)行初免，以腺病毒載體疫苗(Ad5-HIVenv)添加佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，末次免疫后兩周分別采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)免疫小鼠誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。結(jié)果 ELISPOT結(jié)果顯示Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合IL7組小鼠每百萬(wàn)個(gè)脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)(SFC)/106高于疫苗單獨(dú)免疫組小鼠(P<0.05)；IL-7和CpG ODN作為佐劑同時(shí)使用可以進(jìn)一步的提高免疫反應(yīng)(P<0.05)。結(jié)論 Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合IL7佐劑及CpG ODN具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而聯(lián)用IL21佐劑則未見(jiàn)明顯的免疫增強(qiáng)作用。

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China for Infectious Diseases (2012ZXl0001009-005,2012ZX10001009-002-002)

人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)因其高度的變異性和獨(dú)特的復(fù)制周期，直到現(xiàn)在仍然沒(méi)有有效的疫苗問(wèn)世。相較于疫苗單獨(dú)免疫，添加佐劑能誘導(dǎo)出更高強(qiáng)度針對(duì)病原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子及Toll樣受體激動(dòng)劑在免疫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用，因而可作為疫苗佐劑使用[1,2]。IL-7是一類主要由非骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)育成熟的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL-21與其受體結(jié)合后可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖，促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的增殖等。Poly(I:C)是人工合成的雙鏈RNA類似物，目前Poly(I:C)被用于基于樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗等疫苗的佐劑[3]。CpG ODN是一種寡脫氧核苷酸，國(guó)外有臨床研究證明，CpG ODN能顯著增強(qiáng)受體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，作為乙肝疫苗佐劑能提高人體免疫應(yīng)答[4]。本研究通過(guò)比較DNA疫苗(pVR-HIVenv)初免之后，Ad5-HIVenv疫苗單獨(dú)免疫小鼠，以及分別與IL-7、IL-21基因佐劑以及Poly(I:C)、CpG ODN聯(lián)合免疫小鼠的效果，來(lái)探究一種更強(qiáng)的佐劑聯(lián)合免疫方案。

1 材料與方法

1.1 材料 表達(dá)密碼子優(yōu)化的HIV-1 B 亞型env基因的E1、E3缺失的重組5 型腺病毒載體疫苗Ad5-HIVenv、表達(dá)密碼子優(yōu)化的HIV-1 B亞型env基因的pVR質(zhì)粒pVR-HIVenv由本室構(gòu)建[5]，pVR質(zhì)粒由本室保存，4-6周齡的雌性BALB/c小鼠(SCXK2012-0004，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，Mice IFN-γ ELISPOT Kit(Mabtech公司)，PMA、ionomycin(Sigma-Aldrich公司)，env多肽(旭和源生物技術(shù)公司合成)，F(xiàn)uGENE HD(Promega公司)，Poly(I:C)、CpG ODN(InvivoGen公司)，gp120、gp41蛋白(Immune technology公司)，限制性內(nèi)切酶Xbal、BglII(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)小鼠IL-7、IL-21基因的質(zhì)粒pVR-IL7、pVR-IL21的構(gòu)建：本研究以GenBank中小鼠的IL-7、IL-21的氨基酸參考序列出發(fā)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后人工合成IL-7、IL-21基因序列并克隆至pVR質(zhì)粒載體中，構(gòu)建成表達(dá)小鼠IL-7、IL-21的基因佐劑pVR-IL7、pVR-IL21質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切、測(cè)序及Western Blot鑒定。

1.2.2 Ad5-HIVenv疫苗添加IL-7、IL-21基因佐劑及Poly(I:C)、CpG ODN的小鼠分組及免疫：4-6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為8組，每組5只，按表1所示方案免疫小鼠，免疫小鼠采用后肢肌肉注射。免疫劑量分別為：PBS，100 μl/只；DNA(pVR-HIV env)，100 μg/只；Ad5(Ad5-HIVenv)，2×108VP/只；pVR-IL7、pVR-IL21質(zhì)粒、Poly(I:C)、CpG ODN均為100 μg/只。各組小鼠于末次免疫后兩周脫頸處死，眼眶靜脈叢采血并分離血清，同時(shí)取脾臟并分離脾淋巴細(xì)胞。

表1 表達(dá)HIV env的Ad5疫苗與不同佐劑聯(lián)用

1.2.3 HIV-1 env特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)采用ELISPOT法檢測(cè)免疫小鼠誘導(dǎo)的HIV-1 env特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，以1.2.2中分離得到的脾淋巴細(xì)胞作為樣本按照MABTECH公司的Mice IFN-γ ELISPOT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106個(gè)/ml，配制陽(yáng)性刺激物ionomycin(2 μg/ml)和PMA(50 ng/ml)、env多肽(4 μg/ml)。陽(yáng)性孔每孔加入50 μl陽(yáng)性刺激物，實(shí)驗(yàn)孔每孔加入50 μl env多肽，陰性孔每孔加入50 μl 10% FBS的1640培養(yǎng)基，各孔再加入細(xì)胞懸液50 μl，空白孔不加細(xì)胞和刺激物(終體積為100 μl/孔)，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，顯色后記錄斑點(diǎn)數(shù)目，計(jì)算每百萬(wàn)淋巴細(xì)胞中的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(SFC)/106。

1.2.4 HIV-1 env特異性體液免疫反應(yīng)的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)1.2.2中分離得到的血清樣本中g(shù)p120、gp41抗體IgG滴度。在4 ℃過(guò)夜包被gp120、gp41抗原(0.5 μg/ml)的96孔滴定板中，加入從1∶50開(kāi)始4倍梯度稀釋的小鼠血清，37 ℃溫浴1 h；棄血清，洗板機(jī)洗5次，加入辣根氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5000)，37 ℃溫浴1 h；棄二抗，洗板機(jī)洗5次，加顯色液室溫30 min，遮光顯色；最后，加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450/630 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值，計(jì)算抗體滴度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較采用Dunn′s Multiple Comparison 檢驗(yàn)，各組間結(jié)果采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis test，以P<0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

1：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：pVR酶切圖譜；3：pVR-IL7酶切圖譜圖1 pVR和pVR-IL7雙酶切電泳結(jié)果1：DNA Marker;2:Result of pVR;3:Result of pVR-IL7Fig.1 Gel electrophoresis of pVR and pVR-IL7 and their double-digestion patterns

1：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：pVR酶切圖譜；3：pVR-IL21酶切圖譜圖2 pVR和pVR-IL21雙酶切電泳結(jié)果1：DNA Marker;2:Result of pVR;3:Result of pVR-IL21Fig.2 Gel electrophoresis of pVR and pVR-IL21 and their double-digestion patterns

2.1 表達(dá)小鼠IL-7、IL-21基因的重組質(zhì)粒的鑒定。 構(gòu)建的兩個(gè)重組質(zhì)粒(pVR-IL7)和(pVR-IL21)，經(jīng)Xbal和BglII雙酶切鑒定后，均符合預(yù)期結(jié)果(如圖1和圖2所示)。兩質(zhì)粒均送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定，連接框架和準(zhǔn)確性均符合要求，說(shuō)明兩個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2 蛋白表達(dá)與鑒定 以測(cè)序和酶切鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pVR-IL7和pVR-IL21按照FuGENE HD的說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，培養(yǎng)48-72 h后，采用Western Blot鑒定IL-7、IL-21的蛋白表達(dá)，顯示均有外源蛋白表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致。

1：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 2：轉(zhuǎn)染pVR-IL7的293細(xì)胞; 3：正常的293細(xì)胞圖3 質(zhì)粒pVR-IL7中IL7基因表達(dá)水平鑒定1：Prestained Protein Manker; 2:293 cells transfected with pVR-IL7; 3:Mock 293 cellsFig.3 Expression of pVR-IL7 in vitro

1：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2：轉(zhuǎn)染pVR-IL21的293細(xì)胞; 3：正常的293細(xì)胞圖4 質(zhì)粒pVR-IL21中IL21基因表達(dá)水平鑒定1：Prestained Protein Manker; 2:293 cells transfected with pVR-IL21; 3:Mock 293 cellsFig.4 Expression of pVR-IL21 in vitro

2.3 Ad5-HIV env疫苗添加IL-7、IL-21基因佐劑及Poly(I:C)、CpG ODN的小鼠ELISPOT和ELISA結(jié)果 ELISPOT結(jié)果顯示Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑組小鼠(SFC)/106高于疫苗單獨(dú)免疫組小鼠(P<0.05)；Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑及CpG ODN組的(SFC)/106高于Ad5-HI env疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑組(P<0.05)；而添加IL-21基因佐劑組的(SFC)/106與疫苗單獨(dú)免疫組小鼠相比，并沒(méi)有增強(qiáng)作用，如圖5所示。

圖5 免疫小鼠的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)Fig.5 Cellular immune response in immunized mice

通過(guò)ELISA方法進(jìn)一步研究表明，添加佐劑組小鼠血清中g(shù)p120、gp41抗體IgG滴度與疫苗單獨(dú)免疫組相比，并無(wú)顯著性差異(結(jié)果未顯示)。

3 討論

艾滋病毒因其基因具有較大變異性，目前仍沒(méi)有有效的艾滋病預(yù)防性疫苗問(wèn)世，研制治療性疫苗因此成為目前艾滋病疫苗研發(fā)的主要方向，同時(shí)利用各種佐劑如細(xì)胞因子佐劑和Toll樣受體激動(dòng)劑佐劑增強(qiáng)艾滋病疫苗的免疫效力也是目前研究中的新策略。SIN等證實(shí)IL-7作為疫苗佐劑可以增強(qiáng)抗原特異性CTL反應(yīng)[6]。近年來(lái)，一些研究報(bào)道以細(xì)胞因子作為HIV疫苗佐劑可以增強(qiáng)疫苗的免疫效果，其中包括白細(xì)胞介素21[2]。Poly(I:C)、CpG ODN均為Toll樣受體激動(dòng)劑，均能夠通過(guò)與相應(yīng)的受體結(jié)合，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，并增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。

本課題組前期的研究中提出的使用多載體HIV疫苗進(jìn)行重復(fù)和序貫免疫的策略證實(shí)，在接受多載體疫苗序貫免疫的動(dòng)物體內(nèi)能誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)、反應(yīng)強(qiáng)度較高的HIV特異性免疫反應(yīng)。本研究構(gòu)建了表達(dá)小鼠IL7、IL21的質(zhì)粒pVR-IL7和pVR-IL21，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定均正確，并將這兩個(gè)質(zhì)粒瞬

時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，Western blot顯示IL7、IL21均能在293細(xì)胞中有效表達(dá)。我們將pVR-IL7和pVR-IL21質(zhì)粒及Poly(I:C)、CpG ODN以不同的組合聯(lián)合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑及CpG ODN組的細(xì)胞免疫水平高于 Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑組，并且顯著高于疫苗單獨(dú)免疫組；而添加IL-21基因佐劑組與疫苗單獨(dú)免疫組小鼠相比，并沒(méi)有增強(qiáng)作用。這一結(jié)果提示添加pVR-IL7基因佐劑及CpG ODN可以增強(qiáng)艾滋疫苗DNA初免，載體疫苗加強(qiáng)免疫策略誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，為艾滋病疫苗添加佐劑的應(yīng)用提供了參考。

[1] Robert LC, Alan S, Robert AS. Vaccine Adjuvants: Putting Innate Immunity to Work[J]. Immunity, 2010,33(4): 492-503.doi:10.1016/j.immuni.2010.10.002.

[2] Tovey M G, Lallemand C. Adjuvant Activity of Cytokines[J]. Methods Mol Biol, 2010, 626:287-309.doi:10.1007/978-1-60761-585-9_19.

[3] Trumpfheller C, Caskey M, Nchinda G, et al. The Microbial Mimic Poly IC Induces Durable and Protective CD4+ T Cell Immunity together with a Dendritic Cell Targeted Vaccine[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(7):2574-2579.doi:10.1073/pnas.0711976105.

[4] Halperin SA, Ward B, Cooper C, et al. Comparison of safety and immunogenicity of two doses of investigational hepatitis B virus surface antigen co -administered with an immunostimulatory phosphorothioate oligodeoxyribonucleotide and three doses of a licensed hepatitis B vaccine in healthy adults 18-55 years of age[J].Vaccine, 2012,30(15):2556-2563.doi:10.1016/j.vaccine.2012.01.087.

[5] 楊海儒,張凌斐,馮霞,等.表達(dá)HIV-1 B亞型env基因的質(zhì)粒DNA及腺病毒載體疫苗 的免疫原性研究[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2010,24(6):415-417.doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2010.06.007.

[6] Sin Ji, Kim J, Patchuk C,et al.Interleukin 7 can enhance antigen-specific cytotoxic-T-lymphocyte and/or Th2-type immune responses in vivo[J]. Clin Diagn. Lab. Immunol,2000,7(5):751-758.doi:10.1128/CDLI.7.5.751-758.2000.

Adjuvants enhance cellular immune response induced by recombinant adenoviral vector encoding HIV-1 env gene in mice

YuLian,HeXiaozhou,WangWandi,FengXia,XuKe,ZengYi

LaboratoryofVirologyandPharmocology,CollegeofLifeScienceandBioengineering,BeijingUniversityofTechnology,Beijing100124,China(YuL,ZengY); (HeXZ,WangWD,FengX,XuK)

XuKe,Email:xukecdc@163.com;ZengYi,Email:zengyicdc@163.com

Objective To study the immune effects of IL-7, IL-21 as gene adjuvants, Poly(I:C) and CpG ODN for HIV vaccine. Methods Mouse interleukin 7 DNA adjuvant (pVR-IL7) and mouse interleukin 21 DNA adjuvant (pVR-IL21) were constructed. BALB/c mice received DNA prime-adenoviral vector boost immunization with pVR-HIVenv-Ad5-HIVenv alone or combined with pVR-IL7,pVR-IL21, Poly(I:C) and CpG ODN. Cellular and humoral immune responses were assessed by IFN-g enzyme-linked immunosorbent spot assay and enzyme-linked immunosorbent assay. Results Compared with those immunized with vaccines alone, the mice immunized with pVR-IL7 had increased specific cellular response (P<0.05), CpG ODN had synergic effects with IL7 as adjuvants(P<0.05) Conclusion IL7 but not IL21 can enhance the specific cellular immune response of Ad5-HIVenv in mice.

HIV vaccine；Adjuvant；IL-7；IL-21

徐柯，Email：xukecdc@163.com；曾毅，Email：zengyicdc@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.011

HIV疫苗；佐劑；IL-7；IL-21

國(guó)家科技重大專項(xiàng)艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治(2012ZXl0001009-005,2012ZX10001009-002-002)

2016-03-15)