譚珍連 王勇利 麥稚平 廖建 王湛 詹少兵 杜海軍

643200 廣西梧州市疾病預(yù)防控制中心(譚珍連)；廣西自治區(qū)人民醫(yī)院(王勇利)；643200 廣西蒼梧鼻咽癌防治所(麥稚平、廖建);102206 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(王湛、詹少兵、杜海軍)

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·技術(shù)方法·

IgA/ EBV-VCA陽性人群和鼻咽癌患者的EB病毒潛伏膜蛋白2特異性細(xì)胞免疫及EBV DNA載量檢測

譚珍連 王勇利 麥稚平 廖建 王湛 詹少兵 杜海軍

643200 廣西梧州市疾病預(yù)防控制中心(譚珍連)；廣西自治區(qū)人民醫(yī)院(王勇利)；643200 廣西蒼梧鼻咽癌防治所(麥稚平、廖建);102206 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(王湛、詹少兵、杜海軍)

目的 探討IgA/VCA抗體滴度與EBV LMP2特異性細(xì)胞免疫水平和EBV DNA拷貝數(shù)關(guān)系。方法 免疫酶法檢測普查樣本IgA/VCA抗體滴度；選取IgA/VCA抗體陽性人群和治療前鼻咽癌患者，通過γ-干擾素Elispot和EBV DNA熒光定量試劑盒檢測LMP2特異性細(xì)胞免疫水平和血漿中的EBV DNA載量。結(jié)果 普查廣西蒼梧縣城自然人群共1 233人,其中80人IgA/VCA抗體陽性，陽性率為6.0%。對(duì)其中的72例IgA/VCA抗體陽性人群和20未治療的鼻咽癌患者進(jìn)行了LMP2 特異性細(xì)胞免疫和EBV DNA檢測，隨著抗體滴度的升高，LMP2 特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)水平降低，而血漿中EBV DNA拷貝數(shù)有隨IgA/VCA抗體滴度升高而增加的趨勢。 結(jié)論 EBV-LMP2特異性細(xì)胞免疫水平和EBV DNA拷貝數(shù)可能與IgA/VCA抗體滴度相關(guān)。

Fundprograms:NationalBasicResearchProgramofChina(2011CB504800);NationalHigh-techR&DProgramofChina(2012AA02A404);BeijingKeyLaboratoryofEnvironmentalandViralOncology(EV02012021)

EB病毒病毒殼抗原IgA(IgA/VCA)抗體水平可以作為鼻咽癌早期篩的一個(gè)重要指標(biāo)，隨著抗體滴度的上升，發(fā)展成鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[1, 2]。我們以前的研究結(jié)果表明在健康人、IgA/VCA陽性人群和鼻咽癌患者中特異性細(xì)胞免疫水平逐漸降低[3]，在鼻咽癌患者中隨著病情的發(fā)展而患者血漿中EBVDNA的拷貝數(shù)逐漸增加[4]。而在IgA/VCA不同抗體滴度的陽性人群中的細(xì)胞免疫水平如何，血漿中是否存在游離EBVDNA? 研究對(duì)此進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 樣本:廣西壯族自治區(qū)蒼梧縣鼻咽癌普查樣本和自治區(qū)人民醫(yī)院鼻咽癌患者。Ficoll-PaquePLUS淋巴細(xì)胞分離液(GE,美國)；IgA/VCA抗體檢測試劑來自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所；人γ-干擾素Elispot檢測試劑盒(BD,美國)；EBVDNA熒光定量試劑(達(dá)安基因,中國)。

1.2IgA/VCA抗體 以含EB病毒的B95-8細(xì)胞制成抗原片(病毒病預(yù)防控制所)，檢測普查人群血清中IgA/VCA抗體(≥1:5為陽性)，按2倍稀釋梯度確定抗體陽性血清的滴度，具體方法參考文獻(xiàn)[5]。

1.3LMP2特異性細(xì)胞免疫 靜脈抽取抗凝外周血5ml，以淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。按照γ-干擾素Elispot檢測試劑盒操作步驟包被抗體，4℃過夜，次日封閉，室溫孵育2h。接種細(xì)胞1×105/孔，加入LMP2 混合多肽刺激物。同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照1×105/孔(加細(xì)胞1×105/孔+ConA刺激1μg/孔)、陰性對(duì)照(加細(xì)胞1×105/孔)、空白對(duì)照(加200μl/孔培養(yǎng)液)。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)24h。去離子水裂解細(xì)胞，洗液洗滌后，按說明書步驟依次加入檢測抗體、酶標(biāo)的鏈霉親和素和顯色液。將ELISPOT板置于BiosysBioreader4000PRO自動(dòng)讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)，作統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 血漿中游離EBVDNA采用熒光定量PCR法血漿檢測EBV-DNA含量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司StepOnePlusTM), 按EB病毒(EBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作, 提取血漿DNA,取2μl為模板檢測血漿中EBVDNA。以去離子水作陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束，用計(jì)算機(jī)調(diào)取擴(kuò)增結(jié)果。EBVDNA拷貝數(shù)≥5×102/ml判定為陽性。

2 結(jié)果

2.1 普查人群及IgA/VCA抗體滴度 普查自然人群全部來自廣西蒼梧縣城共1 233人,男性622人占50.4%、女性611人占49.6%。年齡段在30-69歲,各年齡組受檢人數(shù)及比例為30-35歲、36-40歲、41-45歲、46-50歲、51-55歲、56-69歲各年齡組受檢人數(shù)分別占9.8%、9.0%、19.0%、18.5%、22.5%、21.2%。通過免疫酶法檢測普查人群的血清中IgA/VCA滴度，其中80人IgA/VCA抗體陽性(>1:5)，陽性率為6.0%。其中多數(shù)(87.5%)的抗體滴度都在1∶5-1∶20之間，1∶40只占2.5%(見表1)。

表1 蒼梧縣城30-70歲健康人群VCA/IgA抗體滴度分布

2.2 LMP2 特異性細(xì)胞免疫檢測80例IgA/VCA抗體陽性人群中，我們獲得了有72例的外周血進(jìn)行了LMP2 特異性細(xì)胞免疫檢測，其中IgA/VCA抗體滴度1∶5為33人、1∶10 30人、1∶20 7人、1∶40 2人，結(jié)果顯示隨著抗體滴度的升高，LMP2 特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)水平降低。從趨勢上看抗體滴度為1∶5和1∶10的LMP2 特異性細(xì)胞免疫水平較接近，而抗體滴度為1∶20和1∶40 的免疫水平較接近，而在1∶10和1∶20之間降幅較大。本研究同時(shí)也對(duì)20例未治療的鼻咽癌患者進(jìn)行了LMP2 特異性細(xì)胞免疫檢測，其細(xì)胞免疫水平低于IgA/VCA陽性人群,鼻咽癌患者的IgA/VCA抗體滴度均在1∶40以上，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，IgA/VCA抗體滴度為1∶5人群與鼻咽癌患者組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

表2 血漿中EBV DNA檢測

圖1 IgA/VCA 抗體陽性人群和鼻咽癌患者LMP2特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答Fig.1 LMP2 specific responses in IgA/VCA-positive population and patients with nasopharyngeal carcinoma

2.3 血漿中游離EBV DNA 我們檢測了72份IgA/VCA抗體陽性和20份鼻咽癌血漿樣本的EB病毒DNA，獲得19例陽性樣本，IgA/VCA抗體陽性樣本8份，鼻咽癌樣本11份。EB病毒拷貝數(shù)范圍從7.6×102/ml至7.5×105/ml不等,鼻咽癌樣本血漿中EBV DNA陽性率高于IgA/VCA抗體陽性樣本。其中VCA/IgA抗體陽性樣本中，血漿EBV病毒載量拷貝數(shù)越高，VCA/IgA抗體滴度越高，但方差分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

3 討論

在20世紀(jì)70年代末的大規(guī)模的血清學(xué)普查表明在人群中，在人群中IgA/VCA抗體陽性率為5.3%(4.7%-6.2%)[6]，2011年的蒼梧縣城人群普查結(jié)果與40年前相似。由于在成人中EBV感染率并沒有變化，因而人群中IgA/VCA抗體陽性率亦沒有改變，鼻咽癌的發(fā)病率亦沒有明顯的降低。在鼻咽癌細(xì)胞中僅表達(dá)有限的幾種EB病毒抗原：EB病毒核抗原1(EBNA1)和潛伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP)1和2 (LMP1，2)。其中，LMP2是EB病毒編碼的晚期表達(dá)蛋白質(zhì)之一, 一種鑲嵌在細(xì)胞膜上的潛伏膜蛋白,是含有CD8+T細(xì)胞識(shí)別表位[7],是理想的靶抗原,因此我們用LMP2作為機(jī)體針對(duì)于EBV的細(xì)胞免疫應(yīng)答。周玲等[3]研究表表明在健康人群、IgA/VCA抗體陽性人群和鼻咽癌患者中，LMP2特異性的細(xì)胞免疫水平逐漸降低。本研究的結(jié)果表明：隨IgA/VCA抗體滴度的升高，LMP2特異性細(xì)胞免疫水平降低。IgA/VCA抗體陽性人群的LMP2 特異性細(xì)胞免疫水平高于鼻咽癌患者，與周玲等的研究結(jié)果一致。血漿中的EBV DNA在臨床中作為鼻咽癌治療后病情進(jìn)展的一個(gè)監(jiān)測指標(biāo)，其變化EBV抗體更敏感，而對(duì)于EBV IgA/VCA陽性的人群檢測尚無不明確。本研究在EBV IgA/VCA陽性樣本的血漿中也發(fā)現(xiàn)了EBV DNA存在，IgA/VCA抗體滴度分別為1∶10和1∶20，滴度在1∶5和1∶40的樣本中未發(fā)現(xiàn)，原因可能是抗體滴度在1∶5的人群機(jī)體免疫與健康人無異，抑制了EBV病毒復(fù)制，血漿中無游離的EBV DNA存在，而抗體滴度1∶40的樣本僅有兩份，樣本數(shù)量所致，未顯示明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果可以提示我們?cè)谠缙谄詹橹校梢詫⒀鍖W(xué)和EBV DNA載量聯(lián)合應(yīng)用。誠然，這僅僅是一次檢測的結(jié)果，且樣本數(shù)量較少，對(duì)于EBV DNA在早期篩查中的意義，還需要更大的樣本，對(duì)其動(dòng)態(tài)變化進(jìn)一步跟蹤。

[1] Zeng Y，Li ZL, Wu YC, et al. Prospective studies on nasopharyngeal carcinoma in Epstein-Barr virus IgA/VCA antibody-positive persons in Wuzhou City, China. Int J Cancer, 1985,36:545-547.

[2] Zeng Y, Li ZJ, LY, et al. Follow-up studies on Epstein-Barr virus IgA/VCA antibody-positive persons in Zangwu County, China. Intervirology, 1983,20:190-194.

[3] 周玲，姚慶云，Steven Lee, 等. 鼻咽癌病人和正常人群中EB病毒特異性T細(xì)胞對(duì)靶抗原的識(shí)別和應(yīng)答. 病毒學(xué)報(bào), 2001,17:11-14.

[4] Lin.JC, Wang WL, ChenKY, et al. Quantification of Plasma Epstein-Barr Virus DNA in Patients with Advanced Nasopharyngeal Carcinoma. N Engl J Med, 2004,350:2461-70.:350:2461-70.doi: 10.1056/NEJMoa032260

[5] 曾毅，沈淑靜，鄧洪,等. 應(yīng)用抗補(bǔ)體免疫酶法從VCA/IgA抗體陽性者中檢查早期鼻咽癌. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào), 1982,4:254-525.[6] Zeng Y, Li ZL, HY, et al. Serological mass survey for early 1detection of nasopharyngeal carcinoma in Wuzhou City, China. Int J Cancer, 1982,29:139-141.

[7] Lee SP, Tierney RJ, Thomas WA， et al. Conserved CTL epitopes within EBV latent membrane protein 2: a potential target for CTL-based tumor therapy. J Immunol, 1997, 158:3325-3334.

Detection of EBV-LMP2-specific cell responses and EBV DNA copies in IgA/EBV-VCA positive individuals and patients with nasopharyngeal carcinoma

TanZhenlian,WangYongli,MaiZhiping,LiaoJian,WangZhan,ZhanShaobing,DuHaijun

WuZhouCenterforDiseaseControlandPrevention,WuZhou643200,China(TanZL);ThePeople’sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China(WangYL);CancerControlOfficeofCangWuCounty,WuZhou643200,China(MaiZP,LiaoJ);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China(WangZ,ZhanSB,DuHJ)

DuHaijun,Email:haijun70@126.com

ObjectiveToinvestigatethecorrelationbetweenEBV-LMP2-specificcellresponses,EBVDNAcopiesandtitersofIgAantibodytoviralcapsidantigen(IgA/VCA).MethodsIgA/VCAantibodyweretestedwithimmune-enzymemethod.BothofplasmaandlymphocyteswererespectivelyseparatedfromIgA/VCA-positiveindividualsandpatientswithnasopharyngealcarcinoma(NPC)withouttreatment.EBVDNAcopiesandLMP2-specificcellresponsesweredetectedbyinterferon-gammaElispotsassayandfluorescentquantitativePCRmethod.ResultsIgA/VCAantibodyin80of1 233individualswaspositiveinCangwucounty,andthepositiverateis6%.EBV-LMP2-specificcellresponsesandEBVDNAcopiesweredetectedin72of80IgA/VCApositiveindividualsandpatientswithNPC.EBVDNAcopiesinplasmawereincreasedwithriseoftitersofIgA/VCAantibody,whileEBV-LMP2-specificcellresponsesweredeclined.ConclusionEBV-LMP2-specificcellresponsesandEBVDNAcopiesareprobablyassociatedwithtitersofIgA/VCAantibody.

IgA/EBV-VCA；latentmembraneprotein2;Cellresponses;EBVDNA

杜海軍, Email: haijun70@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.019

IgA/ EBV-VCA；潛伏膜蛋白2；細(xì)胞免疫；EBV DNA

國家973項(xiàng)目(2011CB504800)；國家863項(xiàng)目(2012AA02A404);環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題項(xiàng)目(EV02012021)

2015-12-01)