李希妍 趙翔 譚敏菊 藍(lán)雨 成艷輝 黃維娟 王大燕 舒躍龍

102206 北京， 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 國家流感中心 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

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·短篇論著·

Sanger法測定季節(jié)性H3N2亞型流感病毒全基因組序列

李希妍 趙翔 譚敏菊 藍(lán)雨 成艷輝 黃維娟 王大燕 舒躍龍

102206 北京， 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 國家流感中心 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 對流行的季節(jié)性甲型H3N2亞型流感病毒進(jìn)行全基因組測序。方法 本文對甲型H3N2亞型流感病毒測序過程中的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行優(yōu)化及精簡，同時(shí)對PCR產(chǎn)物純化方法進(jìn)行了改進(jìn)。使用優(yōu)化后的34對PCR引物和優(yōu)化后的純化方法，對194株甲型H3N2亞型病毒進(jìn)行了測序。結(jié)果 利用優(yōu)化后的測序方法，可保證獲得甲型H3N2亞型流感病毒的8個(gè)片段全基因組序列，而且大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本和人力。結(jié)論 我們應(yīng)大力開展A(H3N2)亞型流感病毒的序列測定工作，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒變異情況，以推選出與人群中的流行株更為匹配的疫苗株。

Fundprogram:NationalScienceandTechnologyMajorProjectofChina(2014ZX10004002-001-003)

甲型H3N2[A(H3N2)]亞型流感病毒于1968年引起了全球范圍的流感大流行，此后一直在人群中呈季節(jié)性流行。對流感病毒表面蛋白HA基因的分析表明，與人群中流行的其他季節(jié)性流感病毒相比，A(H3N2)亞型流感病毒的進(jìn)化和變異最為迅速[1]。流感病毒是分節(jié)段的RNA病毒，對流感病毒全基因組8個(gè)基因片段的綜合分析，可以進(jìn)一步全面揭示流感病毒的重配和變異規(guī)律。既往有研究者曾公布A(H3N2)亞型流感病毒測序引物，本實(shí)驗(yàn)室對此方法進(jìn)行了優(yōu)化，可在10h左右快速獲得A(H3N2)亞型流感病毒的全基因組序列，可用于流感病毒的日常監(jiān)測和研究工作，及時(shí)進(jìn)行病毒進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 毒株來源 本研究的A(H3N2)亞型流感毒株均為國家流感中心保存，病毒分離時(shí)間自2010年1月至2015年10月。

1.2 病毒RNA的提取及基因擴(kuò)增 利用Qiagen公司RNeasyMiniKit試劑盒進(jìn)行RNA提取。從網(wǎng)站http://gsc.jcvi.org/projects/msc/influenza選取人甲型H3N2亞型擴(kuò)增引物，再根據(jù)后續(xù)測序反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行引物優(yōu)化。所有測序引物由大連寶生物公司合成。

使用Qiagen公司OneStepRT-PCRKit進(jìn)行基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μl。具體操作方法參見試劑盒說明書。PCR反應(yīng)條件為60 ℃ 1min；42 ℃ 20min；50 ℃ 20min；95 ℃ 15min；94 ℃ 30s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1min，循環(huán)35次；72 ℃ 10min；4 ℃保存。

1.3PCR產(chǎn)物純化及序列測定PCR產(chǎn)物純化分別使用Qiagen公司QIAquick96PCRPurificationKit和USB公司的ExoSAP-IT，兩種方法進(jìn)行比較。測序反應(yīng)使用美國ABI公司的BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit。由于PCR引物已包含M13接頭，因此用于測序反應(yīng)的引物為通用引物M13。具體方法參見文獻(xiàn)[2]。

1.4 序列分析 序列拼接采用DNAStar軟件中的Seqman程序。序列比對使用MEGA5.0軟件的ClustalW方法。

2 結(jié)果

2.1 純化方法優(yōu)化 最初使用Qiagen公司的QIAquick96PCRPurificationKit濾膜法進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，每純化96個(gè)反應(yīng)約40min，如果樣品量增多，所需的純化時(shí)間將加倍。

改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法后，使用USB公司的ExoSAP-IT蝦堿酶純化，此純化方法在加入蝦堿酶后可用PCR儀進(jìn)行熱反應(yīng)，無論樣品量多少，只需30min即可完成純化。因此更換試劑后，更加節(jié)省時(shí)間及人力。

2.2 引物匹配性優(yōu)化 使用89對PCR引物對A(H3N2)亞型流感病毒進(jìn)行全基因組測序，共測序毒株320株，采樣日期為2010年1月至2014年5月。

在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)部分病毒未能通過一次測序?qū)嶒?yàn)而獲得全基因組序列，個(gè)別引物在對這些病毒進(jìn)行序列測定時(shí)不工作。為了確保所有病毒序列能夠一次測通，對引物序列進(jìn)行了優(yōu)化，使用PrimerPremier5.0軟件，根據(jù)已知病毒序列，設(shè)計(jì)并更換了4對引物，分別為PB1-5、PB1-7、PB1-8和PA-11。2.3 引物數(shù)量優(yōu)化 用89對引物對A(H3N2)亞型流感病毒進(jìn)行PCR反應(yīng)，再使用通用引物M13分別進(jìn)行正反向測序反應(yīng)，最終獲得178條序列，拼接后發(fā)現(xiàn)，每一核苷酸位點(diǎn)有4至9個(gè)測序反應(yīng)。為了節(jié)約成本，能夠在最短時(shí)間內(nèi)完成全基因組測序工作，對測序所使用的PCR引物進(jìn)行精簡。最終確定了34對引物，擴(kuò)增的目的片段之間相互重疊，能夠覆蓋整個(gè)流感病毒全基因組。

2.4 引物驗(yàn)證 使用篩選出的34對引物對采樣日期在2014年3月至2015年10月之間的194株A(H3N2)亞型流感病毒進(jìn)行測序，結(jié)果表明僅使用此34對引物，可以完成流感病毒所有8個(gè)片段的全基因組測序，顯著減少了實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

3 結(jié)論

近年來，下一代測序 (Next-generationsequen-cing，NGS) 技術(shù)相繼出現(xiàn)并迅速發(fā)展成熟。NGS以高通量、低成本為主要特點(diǎn)[3]，不過，由于NGS技術(shù)相關(guān)的儀器費(fèi)用較高，不利于廣泛推廣。而1977年Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法，即第一代測序技術(shù)，擁有較長讀長(平均讀長700bp)和極高準(zhǔn)確率(99.9%)[4]，對于少量測序仍是最佳選擇。

目前有些實(shí)驗(yàn)室已有第一代測序平臺(tái)，但是缺乏有效的測序引物，不能得以充分利用，所以我們希望共享我們優(yōu)化后的測序方法。使用經(jīng)過我們優(yōu)化的測序引物對A(H3N2)流感病毒進(jìn)行測序，其匹配性更高，而且大大減少了PCR擴(kuò)增的數(shù)量，可以節(jié)約成本。

流感病毒抗原性易變，傳播迅速，每年可引起季節(jié)性流行，并且在人群聚集的場所可發(fā)生暴發(fā)疫情。對孕婦、嬰幼兒、老年人和慢性病患者等高危人群的危害尤為嚴(yán)重，接種流感疫苗是目前預(yù)防流感、降低流感疾病負(fù)擔(dān)最有效的手段[5]。由于流感病毒易發(fā)生抗原性漂移和抗原性轉(zhuǎn)變，而目前全球已上市的流感疫苗都不能克服流感病毒易于變異的特點(diǎn)，影響疫苗免疫效果的主要因素為疫苗株和流行株的匹配性，這就需要我們大力開展序列測定和分析工作，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒變異情況，推選出與人群中的流行病毒更為匹配的疫苗株，為人群提供有效的保護(hù)。

表1 用于季節(jié)性H3N2亞型流感病毒測序的PCR引物

續(xù)表1

引物編號NumberofPrimers下游引物名稱Reverseprimers下游引物序列SequenceofreverseprimersPB2-2PB2_H3_R_525CAGGAAACAGCTATGACCAACTTCCATA-ATTACATCTTGTGCPB2-5PB2_H3_R_1080CAGGAAACAGCTATGACCTTYARTGTTTG-GAGATTGCCTGPB2-7PB2_H3_R_1595CAGGAAACAGCTATGACCCCYTGTGTTT-CRCTRACCTCPB2-10PB2_H3_R_2067CAGGAAACAGCTATGACCATCTGGRTCT-TCAATTAAAGTGCPB2-12PB2_H3_R_2341BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGTCGTTTTTAAPB2-15PB2_H3_R_2341BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGTCGTTTTTAAPB1-1PB1_H3_R_530CAGGAAACAGCTATGACCTTATCCATT-GATTCCATCACATCCPB1-5PB1_H3_R_1160CAGGAAACAGCTATGACCTTCAGGTCAAT-GCTTGCTAPB1-7PB1_H3_R_1604CAGGAAACAGCTATGACCACTCCAATGCT-CATGTCAGPB1-10PB1_H3_R_1970CAGGAAACAGCTATGACCTTCCATRCTYT-TGGCTGGACCPB1-12PB1_H3_R_2341BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGCATTTTTPB1-16PB1_H3_R_2341BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGCATTTTTPA-2PA_H3_R_521CAGGAAACAGCTATGACCTCYTCGT-CRAGAGTGTAGTCTGPA-5PA_H3_R_1082CAGGAAACAGCTATGACCTTCTCYTCAK-TYTCAAYRTCMTGPA-9PA_H3_R_1595CAGGAAACAGCTATGACCTCCATRCTCA-CAAARTTTACCACPA-12PA_H3_R_2233BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGTACTTTTTTPA-15PA_H3_R_2233BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGTACTTTTTTHA-2HA_H3_R_589CAGGAAACAGCTATGACCTTGTTTGGCA-TRGTCACGTTCHA-6HA_H3_R_975CAGGAAACAGCTATGACCTTTT-GAAADGGYTTGTCATTGGHA-7HA_H3_R_1323CAGGAAACAGCTATGACCTGTCYTCAACA-TATTTCTCGAGGHA-9HA_H3_R_1733CAGGAAACAGCTATGACCAAACAAGGGT-GTTTTTAATTAATGCHA-11HA_H3_R_1778BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGGTGTTTTNP-3NP_H3_R_520CAGGAAACAGCTATGACCTTCCKGT-KCGAACAAGAGCTCNP-5NP_H3_R_1080BCAGGAAACAGCTATGACCACTTTKGWC-CCTCTGATGAAGCNP-8NP_H3_R_1543CAGGAAACAGCTATGACCTTARTTGTCG-TACTCTTCTGCANP-9NP_H3_R_1565BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGGTATTTTTNA-2NA_H3_R_560CAGGAAACAGCTATGACCTCGTGACAACT-TGAGCTGGACNA-4NA_H3_R_1090CAGGAAACAGCTATGACCTCCCATCCA-CACRTCATTTCCNA-8NA_H3_R_1465BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGAGTTTTTMP-1MP_H3_R_502CAGGAAACAGCTATGACCTGCTGGGAGT-CAGCAATCTGMP-4MP_H3_R_928CAGGAAACAGCTATGACCGACTCAGG-TACTCCTTCCGMP-6MP_H3_R_1027BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGTAGTTTTNS-2NS_H3_R_507CAGGAAACAGCTATGACCAGATTTCGC-CAACAATTGCTCCNS-6NS_H3_R_890BCAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAA-CAAGGGTGYTTTT

[1] Bedford T.，Riley S.，Barr I.G.，et al. Global circulation patterns of seasonal influenza viruses vary with antigenic drift[J]. Nature，2015，523(7559):217-220. doi: 10.1038/nature14460.

[2] 黃維娟，成艷輝，李希妍，等. 2011-2012年度中國H3N2亞型流感病毒病原學(xué)特征分析[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2013，29(3):258-264. doi: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002384.

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[5] 舒躍龍. 中國流感疫苗接種所面臨的挑戰(zhàn)與應(yīng)對策略[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2016，36(1):1-2. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2016.01.001.

Sequencing of seasonal influenza A (H3N2) virus

LiXiyan，ZhaoXiang，TanMinju，LanYu，ChengYanhui，HuangWeijuan，WangDayan，ShuYuelong

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,CollaborationInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention;KeyLaboratoryforMedicalVirology,NationalHealthandFamilyPlanningCommission,Beijing102206,China

WangDayan，Email:dayanwang@cnic.org.cn

ObjectiveTosequencingthewholegenomeofseasonalinfluenzaA(H3N2)viruses.MethodsOptimizedandreducedthePCRprimersofA(H3N2)virus,andimprovedthepurificationmethodofPCRproduction.Usethismethod, 194A(H3N2)virusesweresequenced.ResultsOptimizedsequencingmethodwasusedforfullgenomesequencingofinfluenzaA(H3N2)virus, 8segmentsofallA(H3N2)viruseswereobtained.Thisoptimizedmethodreducedthetimerequiredforsequencing,andsavedexperimentalcost.ConclusionsWeshouldcarryoutthesequencinganalysisofinfluenzaA(H3N2)viruses,totimelyidentifythevariationofviruses,andtoselectmoreappropriatevaccinestrainsforhumanpopulation.

Influenzavirus；H3N2Subtype；Sequencing；Wholegenome

王大燕，Email：dayanwang@cnic.org.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.013

流感病毒；H3N2亞型；測序；全基因組

國家科技重大專項(xiàng)“H7N9等新型流感病毒跨種傳播機(jī)制研究” (2014ZX10004002-001-003)

2016-03-16)