劉春花，吳彬彬，3，陳宏運(yùn)，何鑫平，潘永龍，顏曉慶，楊莉麗，梁巖

（1.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院食品安全及環(huán)境技術(shù)研究室，廣東深圳518055；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化科，廣東深圳518036；3.深圳市中科臺富科技有限公司，廣東深圳518100）

植物發(fā)酵液（酵素）對小鼠免疫功能的影響

劉春花1，吳彬彬1，3，陳宏運(yùn)1，何鑫平1，潘永龍1，顏曉慶1，楊莉麗2，梁巖1

（1.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院食品安全及環(huán)境技術(shù)研究室，廣東深圳518055；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化科，廣東深圳518036；3.深圳市中科臺富科技有限公司，廣東深圳518100）

研究植物發(fā)酵液（酵素）對機(jī)體免疫功能的影響。將雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量及對照組，分別經(jīng)口給予1.25、2.5、5.0mL/kg·BW（相當(dāng)于人推薦日服量的2.5、5、10倍）植物發(fā)酵液及生理鹽水。連續(xù)灌胃4周后，對小鼠非特異性免疫功能和特異性免疫功能有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測定。植物發(fā)酵液（酵素）能明顯提高小鼠胸腺指數(shù)，顯著增強(qiáng)小鼠的碳廓清能力、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能，明顯提高NK細(xì)胞殺傷活性，顯著升高小鼠血清溶血素、溶菌酶水平，促進(jìn)抗體生成細(xì)胞增殖，對小鼠的體重增長、脾臟指數(shù)、Con A誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖分化能力、SRBC誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)無明顯影響。實(shí)驗(yàn)證明植物發(fā)酵液（酵素）對機(jī)體細(xì)胞免疫功能沒有明顯影響，但能顯著提高機(jī)體非特異性免疫功能、體液免疫功能，具有增強(qiáng)免疫力功能的作用。

植物發(fā)酵液；非特異性免疫；體液免疫；細(xì)胞免疫

酵素是一類天然營養(yǎng)保健的發(fā)酵食品，深受日本消費(fèi)者喜愛，近年開始在國內(nèi)受到熱捧。酵素，即植物發(fā)酵液，是指一些新鮮蔬菜、水果、糙米、菇類、藥食同源中藥等植物原料經(jīng)榨汁或萃取工藝后再添加益生菌發(fā)酵［1］，產(chǎn)生的含有豐富多糖、低聚糖、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、酚類、萜類等營養(yǎng)成分及生物活性物質(zhì)的混合液［1-3］。有關(guān)研究表明，植物發(fā)酵液類產(chǎn)品具有調(diào)節(jié)胃腸道、保護(hù)胃粘膜、抗腫瘤、抗氧化等功能活性［4-6］。有文獻(xiàn)報道，植物發(fā)酵液可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖分化能力［7］，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，提示植物發(fā)酵液可能具有調(diào)節(jié)免疫力功能，有待深入研究。因此，本研究從單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能、NK細(xì)胞活性、細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能等多方面考察植物發(fā)酵液對小鼠非特異性免疫和特異性免疫功能的影響，為酵素食品的保健功效和正確合理應(yīng)用提供理論參考。

1　材料和方法

1.1樣品

植物發(fā)酵液（酵素）樣品：由深圳市中科臺富科技有限公司提供。由29種果實(shí)類、44種蔬菜類、7種種子類、12種花蕈及海藻類、16種漢方草本類，共108種植物原料，經(jīng)植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌等微生物發(fā)酵制備。其總可溶性固形物含量65.4％，總酸23.4g/L，總糖708g/L，總酚（以沒食子酸計(jì)）620mg/L，總黃酮（以蘆丁計(jì)）182mg/L。人體口服推薦劑量為30mL，成人體重按60 kg計(jì)算，折合劑量為0.5mL/kg。

1.2主要儀器與試劑

Scientific Multiskan GO全波長讀數(shù)儀、371型二氧化碳培養(yǎng)箱：美國Thermo；CKX41倒置顯微鏡、BX53生物顯微鏡：日本奧林巴斯；UV6100紫外可見分光光度計(jì)：上海精密儀器；5180R臺式高速冷凍離心機(jī)：美國Eppendorf。

綿羊紅細(xì)胞（SRBC）：從北京潤澤康生物科技有限公司購買新鮮脫纖維綿羊血制備；豚鼠血清：廣州聚聯(lián)生物技術(shù)有限公司；雞紅細(xì)胞：從深圳農(nóng)貿(mào)市場購買健康公雞通過靜脈取血制備；印度墨汁：北京潤澤康生物科技有限公司；YAC-1細(xì)胞：武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液：美國Gibco公司；胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司；β-巰基乙醇：美國Amresco公司；氧化型輔酶Ⅰ（NADⅠ）：上海生物工程有限公司；刀豆蛋白A（Con A）、都氏試劑：美國Sigma公司；總蛋白（TB）、白蛋白（ALB）、總抗氧化能力（T-AOC）、溶菌酶（LZM）、一氧化氮（NO）測定試劑盒、快速瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液：南京建成生物工程研究所；其它為常規(guī)試劑。

1.3實(shí)驗(yàn)動物

雄性清潔級BALB/c小鼠，體重（18±2）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證為：SCXY（粵）2013-0002，在深圳市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動物屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為：SYXK（粵）2010-0068。

1.4動物分組與劑量選擇

實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按體重隨機(jī)分為3個實(shí)驗(yàn)大組，免疫一組進(jìn)行小鼠體重、免疫器官指數(shù)測定及小鼠碳廓清試驗(yàn)，二組測定腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)、NK細(xì)胞功能、Con A誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖分化試驗(yàn)，三組測定SRBC誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)（DTH）反應(yīng)、抗體生成細(xì)胞測定、血清溶血素、血清溶菌酶等指標(biāo)，每組8只～9只。每個試驗(yàn)大組均設(shè)對照組及低、中、高劑量組4個小組。

低、中、高劑量組小鼠分別經(jīng)口灌胃給予植物發(fā)酵液（酵素）樣品，劑量分別為1.25、2.50、5.00mL/kg·BW，相當(dāng)于人推薦日攝入量0.50 mL/kg·BW的2.5、5、10倍，對照組灌胃生理鹽水，每天灌胃1次，體積為10mL/kg·BW，連續(xù)灌胃4周以上。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由攝食飼料和水，于末次給予受試物后對動物進(jìn)行各項(xiàng)免疫指標(biāo)測定。

1.5方法

1.5.1體重、免疫器官指數(shù)測定

稱重后處死小鼠，取脾臟、胸腺，濾紙吸干血污后在電子分析天平上稱重，計(jì)算臟/體比值。

免疫器官指數(shù)=胸腺（或脾臟）質(zhì)量（mg）/體重（g）

1.5.2血清基本免疫指標(biāo)測定

小鼠摘除眼球取血于離心管內(nèi)，室溫放置約1 h，使血清充分析出，5 000 r/min離心10min，收集血清，于-80℃保存。參照試劑盒說明書，測定血清TB、ALB、T-AOC、LZM、NO濃度。

1.5.3其他免疫指標(biāo)的測定

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）［8］免疫功能檢測的程序，分別測定下列各項(xiàng)免疫指標(biāo)：小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（半體內(nèi)法）、NK細(xì)胞活性（LDH法）、Con A誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖分化實(shí)驗(yàn)（MTT法）、SRBC誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）、抗體生成細(xì)胞測定（Jerne改良法）、血清溶血素測定（HC50法）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果與分析

2.1植物發(fā)酵液對小鼠體重、免疫器官指數(shù)的影響

植物發(fā)酵液對小鼠體重、胸腺及脾臟指數(shù)的影響見圖1。

圖1　植物發(fā)酵液對小鼠體重、胸腺及脾臟指數(shù)的影響（±s，n=8～9）Fig.1 Effectof plant fermentation extractson thebody weight，thymusand spleen index inm ice（±s，n=8～9）

由圖1可見，與對照組相比，低、中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)分別升高了18.18％、15.15％、18.94％，其中低、高劑量組差異顯著（均P＜0.05），各劑量組小鼠體重、脾臟指數(shù)差異不顯著（均P＞0.05），表明植物發(fā)酵液對小鼠胸腺的生長發(fā)育具有一定促進(jìn)作用。

2.2植物發(fā)酵液對小鼠單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能的影響

植物發(fā)酵液對小鼠單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能的影響見圖2。

由圖2可見，與對照組相比，各劑量組小鼠碳廓清指數(shù)k、吞噬指數(shù)a均有所提高，其中低、中劑量組小鼠碳廓清指數(shù)k分別顯著升高了54.52％、43.77％（均P＜0.01），吞噬指數(shù)a分別顯著提高了14.52％（P＜0.05）、24.66％（P＜0.01），表明植物發(fā)酵液對小鼠碳廓清功能具有促進(jìn)作用。與對照組相比，各劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)b均有所提高，其中高劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)b分別明顯提高了54.87％、62.85％（均P＜0.05），表明植物發(fā)酵液對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有一定促進(jìn)作用。

2.3植物發(fā)酵液對小鼠NK細(xì)胞功能的影響

植物發(fā)酵液對小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響見圖3。

由圖3可見，與對照組相比，中、高劑量組小鼠NK細(xì)胞活性分別明顯升高了52.87％、51.29％（均P＜0.01），低劑量組無明顯變化，表明植物發(fā)酵液對小鼠NK細(xì)胞活性具有促進(jìn)作用。

圖3　植物發(fā)酵液對小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響（±s，n=8）Fig.3 Effectof plant fermentation extractson the killing activity of NK cells inm ice（±s，n=8）

2.4植物發(fā)酵液對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

植物發(fā)酵液對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響見圖4。

圖4　植物發(fā)酵液對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響（±s，n=8）Fig.4 Effectof plant fermentation extractson the cellular imm unity inm ice（±s，n=8）

由圖4可見，與對照組相比，各劑量組Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖分化能力、SRBC誘導(dǎo)的小鼠DTH反應(yīng)中小鼠足跖腫脹度雖有所增加，但差異不顯著（均P＞0.05），表明植物發(fā)酵液對小鼠細(xì)胞免疫功能沒有明顯影響。

2.5植物發(fā)酵液對小鼠體液免疫功能的影響

植物發(fā)酵液對小鼠體液免疫功能的影響見圖5。

圖5　植物發(fā)酵液對小鼠體液免疫功能的影響（±s，n=8）Fig.5 Effectof plant ferm entation extractson thehum oral imm unity inm ice（±s，n=8）

由圖5可見，與對照組相比，低、高劑量組小鼠的溶血空斑數(shù)分別明顯增加了21.98％、26.36％（均P＜0.01），中劑量組小鼠的溶血空斑數(shù)雖有所增加但差異不顯著，該結(jié)果表明植物發(fā)酵液具有一定的促進(jìn)小鼠抗體生成細(xì)胞增殖的作用。與對照組相比，低、中、高劑量組小鼠血清半數(shù)溶血值分別顯著升高了2.71％、4.40％、2.89％（均P＜0.01），表明植物發(fā)酵液能夠提高小鼠血清溶血素水平。以上數(shù)據(jù)表明植物發(fā)酵液對小鼠體液免疫功能具有明顯的促進(jìn)作用。

2.6植物發(fā)酵液對小鼠血清生化指標(biāo)影響

植物發(fā)酵液對小鼠血清部分免疫指標(biāo)的影響見表1。

表1　植物發(fā)酵液對小鼠血清部分免疫指標(biāo)的影響（±s，n=8）Table1 Effectof p lant ferm entation extractson the serumimmune indexs inm ice（±s，n=8）

表1　植物發(fā)酵液對小鼠血清部分免疫指標(biāo)的影響（±s，n=8）Table1 Effectof p lant ferm entation extractson the serumimmune indexs inm ice（±s，n=8）

注：與對照組相比，#表示差異顯著；P＜0.05，##表示差異極顯著，P＜0.01。

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組TB/（g/L）47.83±1.24 48.46±2.04 48.04±2.72 47.45±2.78 ALB/（g/L）28.74±1.92 28.12±1.35 27.98±1.85 28.45±1.77 LZM/（μg/mL）1.66±1.01 4.31±1.95##4.27±1.14##3.50±1.69#NO/（μmol/L）41.05±9.90 46.38±8.24 41.08±10.05 57.6±20.65 T-AOC/（U/mL）5.75±0.97 5.19±1.19 6.28±0.87 7.67±2.44#

由表1可見，與對照組相比，低、中、高劑量組小鼠血清LZM水平分別明顯升高了1.60、1.57、1.11倍（均P＜0.05），表明植物發(fā)酵液可明顯提高血清LZM水平，增強(qiáng)機(jī)體抗菌能力。此外，與對照組相比，中、高劑量組小鼠血清T-AOC能力有所上升，高劑量組明顯提高了33.39％（P＜0.05），表明植物發(fā)酵液可提高小鼠血清抗氧化能力，進(jìn)而影響機(jī)體免疫力。另外，與對照組相比，各劑量組小鼠血清TB、ALB、NO水平差異不顯著（均P＞0.05），表明植物發(fā)酵液對小鼠血清TB、ALB、NO水平?jīng)]有明顯影響。

3　討論與結(jié)論

研究表明，植物發(fā)酵類食品具有調(diào)節(jié)免疫力功能［9-11］，如雙歧桿菌混合發(fā)酵制備的發(fā)酵果蔬汁［10］、添加了人參提取物的益生菌發(fā)酵制備的混合果蔬發(fā)酵飲品［11］。生物有著非常強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)與產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物的能力，微生物發(fā)酵過程可以降解動植物原料中的有害物質(zhì)和不易吸收物質(zhì)，抑制病原菌生長，產(chǎn)生豐富多樣的活性酶、營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)［9］。有研究發(fā)現(xiàn)敖東酵素能夠顯著增強(qiáng)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力［7］。本研究對植物發(fā)酵液的調(diào)節(jié)免疫力功能進(jìn)行了綜合評價，發(fā)現(xiàn)植物發(fā)酵液可顯著增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性、體液免疫功能，具有增強(qiáng)免疫力活性。

非特異性免疫，又稱為先天性免疫，既是機(jī)體的第一道免疫防線，又是特異性免疫的基礎(chǔ)［12］。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，其體指數(shù)可以直觀地反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱［9］。本實(shí)驗(yàn)中，植物發(fā)酵液各劑量組小鼠脾臟指數(shù)沒有明顯變化，但胸腺指數(shù)均有所提高，表明其可在一定程度上提高機(jī)體免疫能力。單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)對異物具有很強(qiáng)的吞噬功能，是機(jī)體非特異性免疫功能的指標(biāo)之一［10］。本實(shí)驗(yàn)中，低、中劑量植物發(fā)酵液顯著提高了小鼠碳廓清指數(shù)k、吞噬指數(shù)a，高劑量植物發(fā)酵液明顯提高了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)b、吞噬百分率，表明其可增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能。NK細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，可直接非特異性殺傷靶細(xì)胞，是機(jī)體非特異性免疫的重要組成［12］。本實(shí)驗(yàn)中，中、高劑量植物發(fā)酵液能顯著提升小鼠NK細(xì)胞活性，表明其可增強(qiáng)NK細(xì)胞功能。溶菌酶具有溶菌作用，在抵抗外界細(xì)菌入侵時起著重要作用［13］。本實(shí)驗(yàn)中，低、中、高劑量植物發(fā)酵液均可顯著升高小鼠血清溶菌酶水平，表明其可增強(qiáng)機(jī)體抗菌防御能力。因此，植物發(fā)酵液（酵素）可通過增強(qiáng)機(jī)體單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞功能等，提高機(jī)體非特異性免疫功能。

特異性免疫，又稱為獲得性免疫，具有抗原特異性，可分為細(xì)胞免疫、體液免疫［14］。細(xì)胞免疫主要是指T淋巴細(xì)胞借由釋放淋巴因子發(fā)揮的免疫應(yīng)答過程，體液免疫是指外來抗原誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體來達(dá)到保護(hù)目的的免疫反應(yīng)，兩者相輔相成，共同發(fā)揮免疫作用。淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是檢測機(jī)體細(xì)胞免疫功能的常用方法［11］。本實(shí)驗(yàn)中，與文獻(xiàn)報道不同［7］，本實(shí)驗(yàn)中各劑量組小鼠的Con A誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖分化能力、SRBC誘導(dǎo)的足跖腫脹度較對照組沒有明顯變化，表明其對機(jī)體細(xì)胞免疫功能沒有明顯影響?？贵w生成細(xì)胞檢測及血清溶血素的測定能夠反映機(jī)體的體液免疫狀態(tài)［15］。本實(shí)驗(yàn)中，低、高劑量植物發(fā)酵液顯著提高正常小鼠的SRBC誘導(dǎo)的溶血空斑數(shù)，低、中、高劑量酵素均能顯著提升血清溶血素水平，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞快速增殖分化和抗體生成能力，表明其能夠增強(qiáng)機(jī)體體液免疫功能。因此，植物發(fā)酵液（酵素）可通過增強(qiáng)體液免疫功能，提高機(jī)體特異性免疫功能。

綜上所述，植物發(fā)酵液（酵素）可以增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能、NK細(xì)胞活性、體液免疫功能，提高血清溶菌酶水平，進(jìn)而提高機(jī)體非特異性免疫功能和特異性免疫功能。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》［8］中的判斷標(biāo)準(zhǔn)，植物發(fā)酵液（酵素）具有增強(qiáng)免疫力功能。

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The Immunom odulatory Effect of the Plant Fermentation Extracts（PFE）in M ice

LIU Chun-hua1，WU Bin-bin1，3，CHEN Hong-yun1，HE Xin-ping1，PAN Yong-long1，YAN Xiao-qing1，YANG Li-li2，LIANG Yan1
（1.Lab for Food Safety and Environmental Technology，Shenzhen Institutes of Advanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518055，Guangdong，China；2.Digestive Department of the Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen 518036，Guangdong，China；3.Shenzhen CAS-TFTechnology Co. Ltd.，Shenzhen 518100，Guangdong，China）

Effect of plant fermentation extracts（PFE）on immune functions in mice was investigated.Male BALB/c mice were randomly divided into four groups and orally administered a plant fermentation extracts（PFE）atdaily dosages of1.25，2.50，5.00mL/kg·BW（comparatively as 2.5，5，10 timesof recommended human daily dosage）respectively.Normalsalinewasused as the control.After4weeks，indexesofnon-specific and specific immunity function inmicewere examined.Compared with the control，plant fermentation extracts significantly increased the thymus index，improved the abilities of carbon particle clearance and peritoneal macrophage phagocytizing chicken red blood cells.The killing activity of NK cells，the levelof serum lysozyme and hemolysin，and the productive ability ofantibody forming cellswere also greatly increased.No obviousdifferences in the bodyweight，spleen index，con A-induced splenic lymphocyte proliferation and theability ofdelayed type hypersensitivity induced by SRBCwere observed in our study.These results indicated that the plant fermentation extracts（PFE）had noobvious impacton cellular immunity，butsignificantly strengthen thenonspecific immune function and humoral immunity inmice.Overall，plant fermentation extracts（PFE）possess enhancing immunity property.

plantfermentationextracts；non-specific immune function；humoralimmunity；cellularimmunity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.041

深圳市知識創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20140415162542973）；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（CXZZ20150422152108120）；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（CXZZ20150529144041624）

劉春花（1987—），女（漢），研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向：食品科學(xué)、分子營養(yǎng)學(xué)、生物功能活性物質(zhì)。

2015-10-26