鄭麗雪，陳婧瑛，王立梅，齊斌，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟215500）

不同培養(yǎng)基對(duì)丙酸桿菌生長及代謝物抑菌特性的影響

鄭麗雪1，2，陳婧瑛1，王立梅1，2，齊斌1，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟215500）

以實(shí)驗(yàn)室保存的一株費(fèi)氏丙酸桿菌CS1420（Propionibacterium freudenreichii CS1420）為試驗(yàn)菌株，比較該菌株在改良PYG培養(yǎng)基中和在乳酸鈉培養(yǎng)基中的生長情況及代謝物的抑菌作用。結(jié)果表明：兩種發(fā)酵液中還原糖含量的變化趨勢(shì)基本一致；試驗(yàn)菌株對(duì)乳酸鈉的利用略優(yōu)于對(duì)葡萄糖的利用；從發(fā)酵液生物量看，菌株在PYG培養(yǎng)基中的生長情況略優(yōu)于在乳酸鈉培養(yǎng)基中的生長情況；兩種發(fā)酵液的pH都是從初始的7.0降至4.5左右；當(dāng)用改良PYG培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)酵后期發(fā)酵液抑菌作用最強(qiáng)；當(dāng)用乳酸鈉培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)酵前期發(fā)酵液抑菌作用最強(qiáng)。

費(fèi)氏丙酸桿菌；改良PYG培養(yǎng)基；乳酸鈉培養(yǎng)基；生長；抑菌性

目前，世界各國都在致力于廣譜、安全、高效的食品防腐劑的研發(fā)。日本早已全面禁止苯甲酸鈉的使用，我國也在逐步縮小苯甲酸鈉的使用范圍和使用量。從食品防腐劑的生產(chǎn)與產(chǎn)品開發(fā)看，天然、安全的食品防腐劑將成為主流，例如微生物源的防腐劑［1］。丙酸桿菌細(xì)菌素（由丙酸桿菌代謝產(chǎn)生的，具有殺菌作用的蛋白質(zhì)或多肽）具有廣泛的抑菌作用［2］，且抑菌效果優(yōu)于山梨酸鉀和苯甲酸鈉等常見的化學(xué)防腐劑，所以，丙酸桿菌細(xì)菌素在食品防腐保鮮中具有很好的應(yīng)用前景。法國羅地亞公司已經(jīng)開發(fā)得到一種含有丙酸桿菌細(xì)菌素的新型生物防腐劑，得到了美國FDA的批準(zhǔn)，已在美國和歐洲市場上銷售。

近年來，國內(nèi)學(xué)者也開始展開有關(guān)丙酸桿菌生長代謝及產(chǎn)細(xì)菌素等方面的研究，如：潘淼等［3］對(duì)一株薛氏丙酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并研究了抑菌產(chǎn)物性質(zhì)；馮晗等［4］，榮紹豐等［5］分別研究了丙酸桿菌代謝物對(duì)惡臭假單胞菌、酵母菌的抑制作用；陳玉梅等［6］研究了不同碳源對(duì)薛氏丙酸桿菌生長及代謝物抑菌活性的影響。本文研究了不同培養(yǎng)基對(duì)一株費(fèi)氏丙酸桿菌生長及代謝物抑菌特性的影響，旨在為后續(xù)的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種

費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420，以下簡稱為P.freudenreichii CS1420）、大腸桿菌（ATCC25922）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae 2-10515，以下簡稱為S.cerevisiae 2-10515）均為常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程中心保存。

1.2儀器

CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FA604A型精密電子天平：上海精天電子儀器有限公司；LHR-250型霉菌培養(yǎng)箱：上海索譜儀器有限公司；SW-CJ-1B超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；Bio-Rad xMark酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司；Bio-Rad 1575洗板機(jī)：美國Bio-Rad公司；Milli-QAdvantage超純水儀：美國Millipore公司。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1丙酸桿菌培養(yǎng)基

1.3.1.1改良PYG培養(yǎng)基

酪蛋白胨5.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母提取物10.0 g，牛肉提取物5.0 g，葡萄糖5.0 g，K2HPO42.0 g，吐溫80 1.0 mL，刃天青1.0mL，鹽溶液（CaCl2·2H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，NaHCO310.0 g，NaCl2.0 g，蒸餾水1.0 L。）40.0mL，氯化血紅素溶液（氯化血紅素50.0mg，1mol/LNaOH 1.0mL，蒸餾水99.0mL）10.0mL，維生素K1溶液（維生素K10.1mL，95％乙醇20.0mL）0.2mL，L-半胱氨酸0.5 g，蒸餾水950.0mL，pH 7.2。

1.3.1.2乳酸鈉培養(yǎng)基

乳酸鈉5.0 g，酵母膏10.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.2 g，Tween80 1.0 g，蒸餾水1.0 L，pH7.0。

1.3.2大腸桿菌培養(yǎng)基

牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000mL，pH 7.0。

1.3.3酵母菌培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基［7］。

1.4菌種活化

將保存的P.freudenreichii CS1420菌株分別劃線接種到改良PYG固體培養(yǎng)基和乳酸鈉固體培養(yǎng)基上，30℃厭氧培養(yǎng)2.5 d，連續(xù)活化兩代。

挑取平板上活化好的大腸桿菌ATCC25922接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h；挑取平板上活化好的S.cerevisiae 2-10515單菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。

1.5不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)P.freudenreichii CS1420生長及代謝物抑菌特性的影響

1.5.1不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液還原糖的影響

將活化好的P.freudenreichii CS1420種子液分別接種到改良PYG培養(yǎng)基和乳酸鈉液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)10 d，每天定時(shí)取樣，離心，取上清液1mL，采用DNS法［8］測(cè)定上清液中還原糖含量，考察不同培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液還原糖的變化情況。

1.5.2不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液生物量的影響

按照1.5.1方法取樣后，分別以改良PYG培養(yǎng)基和乳酸鈉液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在620 nm處分別測(cè)定發(fā)酵液吸光度值，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以樣品吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出曲線，以此考察不同培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液生物量的變化情況。

1.5.3不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液pH的影響

按照1.5.1方法取樣后，將發(fā)酵液離心，采用梅特勒酸度計(jì)測(cè)定上清液pH。

1.5.4不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液抑菌作用的影響

1）測(cè)定改良PYG培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌ATCC25922、Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用，方法同前期研究［9］，將1mL活化好的大腸桿菌菌液接入9mL已滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后向其中分別加入不同時(shí)間的丙酸桿菌發(fā)酵上清液0.5mL，混合液于36℃條件下培養(yǎng)24 h，以一只9mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基+1mL指示菌液+0.5mL丙酸桿菌培養(yǎng)基管作為空白對(duì)照管，在波長620 nm下測(cè)定混合液吸光度值。

2）測(cè)定乳酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌ATCC-25922、Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用，方法同1），只是將發(fā)酵培養(yǎng)基改為乳酸鈉培養(yǎng)基。

2　結(jié)果與討論

2.1不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液還原糖的影響

不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液還原糖的影響見圖1。

圖1　不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液還原糖的影響Fig.1 Effectsof different culturem edia on reducing sugar in fermentation broth

從圖1可以看出，培養(yǎng)基無論用乳酸鈉或用葡萄糖作為碳源，發(fā)酵液還原糖的變化趨勢(shì)一致，1 d內(nèi)，發(fā)酵液中的還原糖含量分別降至1.5 g/L和1.9 g/L，之后一直到第10天，發(fā)酵液還原糖含量緩慢降低并趨于平穩(wěn)。從數(shù)據(jù)來看，試驗(yàn)菌株對(duì)乳酸鈉的利用略優(yōu)于對(duì)葡萄糖的利用。

2.2不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液生物量的影響

不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液生物量的影響見圖2。

圖2　不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液生物量的影響Fig.2 Effectsof different culturemedia on biomass in ferm entation broth

從圖2可以看出，以PYG培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液生物量在第1天增長最快，第2天開始緩慢增長至第4天達(dá)到峰值，之后趨于平穩(wěn)，第8天后，生物量又略有下降；以乳酸鈉培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)酵液生物量在前兩天增長迅速，之后緩慢增長趨于平穩(wěn)，第8天后略有下降，總體來看，試驗(yàn)菌株在PYG培養(yǎng)基中的生長情況略優(yōu)于在乳酸鈉培養(yǎng)基中的生長情況。

2.3不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液pH的影響

不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液pH的影響見圖3。

從圖3可以看出，兩組發(fā)酵液pH都是在第1天下降最快，分別從初始pH降到了4.5、4.7，之后緩慢降低，在發(fā)酵第10天時(shí)，pH分別降至4.3、4.5。

圖3　不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液pH的影響Fig.3 Effectsof different culturem edia on pH in fermentation broth

2.4改良PYG培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌ATCC25922、Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用

經(jīng)改良PYG培養(yǎng)基發(fā)酵后，不同時(shí)間發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌ATCC25922、Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用見圖4、圖5。

圖4　改良PYG培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌ATCC25922的抑制作用Fig.4 Inhibition effectsof fermentation liquid on E.coli ATCC29522 by usingmodified PYG culturemedium

圖5改良PYG培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)Saccharomyces cerevisiae2-10515的抑制作用Fig.5 Inhibition effectsof ferm entation liquid on Saccharomyces cerevisiae2-10515 by usingmodified PYG culturemedium

圖4、圖5中0 d為空白對(duì)照組，采用1.5.4方法，將活化后的大腸桿菌菌液、酵母菌菌液中分別加入不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵上清液，24 h后，混合液在620 nm處的OD值都低于空白，這說明，P.freudenreichii CS1420在改良PYG培養(yǎng)基中發(fā)酵后代謝物對(duì)大腸桿菌ATCC25922、Saccharomyces cerevisiae 2-10515均有抑制作用，并且都是在發(fā)酵后期（第9天左右），發(fā)酵液抑菌作用最明顯。

2.5乳酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌ATCC25922、Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用

經(jīng)乳酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵后，不同時(shí)間發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌ATCC25922、Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用見圖6、圖7。

圖6　乳酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌ATCC25922的抑制作用Fig.6 Inhibition effectsof ferm entation liquid on E.coli ATCC29522 by using sodium lactate culturem edium

圖7乳酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用Fig.7 Inhibition effectsof fermentation liquid on Saccharomyces cerevisiae2-10515 by using sodium lactate culturem edium

圖6、圖7結(jié)果表明，P.freudenreichii CS1420在乳酸鈉培養(yǎng)基中發(fā)酵后，代謝物對(duì)大腸桿菌、酵母菌也都有抑制作用，但是，發(fā)酵前期（第2天～第3天左右）的發(fā)酵液抑菌作用最明顯。由本實(shí)驗(yàn)室前期的研究可知，丙酸桿菌代謝產(chǎn)物中有抑菌作用的物質(zhì)主要是丙酸桿菌素、丙酸、乙酸等［9］，其中起作用的主要是丙酸桿菌素，丙酸桿菌細(xì)菌素是由丙酸桿菌代謝合成的蛋白質(zhì)或多肽，從2.4、2.5試驗(yàn)結(jié)果看，可能在改良PYG培養(yǎng)基中，丙酸桿菌素的大量分泌是在發(fā)酵后期，在乳酸鈉培養(yǎng)基中，丙酸桿菌素的大量分泌是在發(fā)酵前期。說明同一菌株利用不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物種類及產(chǎn)量影響很大［10-11］。

3　結(jié)論

P.freudenreichii CS1420菌株分別在改良PYG培養(yǎng)基和乳酸鈉培養(yǎng)基中發(fā)酵后：

1）從還原糖的消耗看，該菌株對(duì)乳酸鈉的利用略優(yōu)于對(duì)葡萄糖的利用。

2）從發(fā)酵液生物量看，該菌株在PYG培養(yǎng)基中的生長情況略優(yōu)于在乳酸鈉培養(yǎng)基中的生長情況。

3）兩組發(fā)酵液的pH都是從初始的7.0降至4.5左右。

4）同一菌株利用不同培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物種類及產(chǎn)量影響很大，當(dāng)用改良PYG培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)酵后期發(fā)酵液抑菌作用最強(qiáng)；當(dāng)用乳酸鈉培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)酵前期發(fā)酵液抑菌作用最強(qiáng)。

［1］賈士儒.生物防腐劑［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2009：9

［2］Leversee JA，Glatz BA.Detection of the bacteriocin propionicin PLG-1 with polyvalent anti-PLG-1 antiserum.［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67（5）：2235-2239

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Effects of Different Culture Medium on Grow th and Metabolites Antim icrobial Activity of Propionibacterium

ZHENG Li-xue1，2，CHEN Jing-ying1，WANG Li-mei1，2，QI Bin1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Propionibacterium freudenreichii CS1420 was used as experimental strain.Growth andmetabolites antimicrobialactivity of thestrainwascompared in the improvementofPYG cultureand in sodium lactatemedium.The results showed：the change trend of reducing sugar content in the two kinds of fermentation liquid was basically the same，theutilization of lactic acid sodium wasslightly better than thatofglucose.Thegrowth of the strain in PYG medium was slightly better than that in the growth of sodium lactate medium compared by biomass.pH of the two kinds of fermentation liquid were from 7 to 4.5.The inhibitory effectof the fermentation broth was the strongest in the late fermentation when themodified PYGmedium was used as themedium.The strongest inhibitory effectwasproduced by the early fermentationwhen using sodium lactate.

Propionibacterium freudenreichii；modified PYG medium；sodium lactate medium；growth；antimicrobialactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.039

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（BE2013339）；蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（SYN201226）；蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（SYN201417）；常熟理工學(xué)院重點(diǎn)畢業(yè)論文資助項(xiàng)目（1649LG）

鄭麗雪（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

2015-11-04