權(quán)伍榮，康優(yōu)，沈明浩

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林龍井133400；2.長春市食品藥品監(jiān)督管理局，吉林長春130051；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

蘋果梨中多酚氧化酶的性質(zhì)及多酚成分定性

權(quán)伍榮1，康優(yōu)2，沈明浩3，*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林龍井133400；2.長春市食品藥品監(jiān)督管理局，吉林長春130051；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

以蘋果梨中的多酚氧化酶（PPO）為研究對(duì)象，對(duì)其酶的性質(zhì)及多酚成分進(jìn)行研究。采用分光光度法測(cè)定酶活，利用高效液相色譜法定性蘋果梨果肉中的酚類物質(zhì)。PPO在pH值為7.8時(shí)酶活波峰最大，在7.4時(shí)酶活下降趨勢(shì)最不明顯；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?mmol/L時(shí)，隨著濃度的增加，PPO活性反而下降，底物為表兒茶酚時(shí)酶活最強(qiáng)；蘋果梨果肉中可檢測(cè)到的酚類物質(zhì)包括兒茶酚、綠原酸、表兒茶素和槲皮素。結(jié)果表明：PPO的最適pH值為7.8，PPO在pH為7.4時(shí)最穩(wěn)定；表兒茶酚和PPO的親和力最高；蘋果梨中的酚類物質(zhì)綠原酸含量最多，其次含量較高的是兒茶素和槲皮素。

蘋果梨；多酚氧化酶；高效液相；定性；含量

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，簡稱PPO）在植物界乃至動(dòng)物界分布廣泛，由于其檢驗(yàn)方便，使被最早研究的幾類酶之一［1］。

蘋果梨（PyrusPyrifolia Nakai）是吉林延邊自治州特產(chǎn)，品質(zhì)上等，極耐貯藏，但加工時(shí)極易褐變，影響了商品價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。而梨中的多酚氧化酶是引起褐變的主要因素之一［2］。多酚氧化酶能催化各種酚類物質(zhì)氧化成為醌，醌類化合物是具有高反應(yīng)性的物質(zhì)，可以參與許多不同的反應(yīng)途徑，它們是強(qiáng)親電試劑，在果蔬衰老和貯藏過程中可以被其它酚類化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)親核攻擊而產(chǎn)生深褐色或者黑色的色素，并隨時(shí)間的延長而逐漸變黑［3-5］。

所以以蘋果梨為原材料，必須掌握多酚氧化酶的酶學(xué)特性，不然用蘋果梨做出的成品，從口味上，從感官上，都很難滿足消費(fèi)者的要求，而且不能把握好制成品的各種指標(biāo)。針對(duì)這些問題，本文旨在研究多酚氧化酶的酶學(xué)特性及其定性，為進(jìn)一步闡明蘋果梨褐變機(jī)制以及開發(fā)蘋果梨貯藏及加工過程中的護(hù)色保鮮技術(shù)提供一定的理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

無損傷、品質(zhì)良好的延邊蘋果梨。

1.2試劑

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、Tris、鹽酸、硼砂、氫氧化鈉：北京化工廠；甲醇、乙腈、PVPP（聚乙烯吡烷酮）、表兒茶酚、兒茶酚、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸、無水亞硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鉀、硝酸鋁：北京鼎國生物技術(shù)有限公司；以上均為色譜純。

1.3儀器

AnkeGL-20G-II離心機(jī)：上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）真空泵抽濾裝置：上海博爾康電子有限公司；TU-1810北京普析通用紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JB-3A磁力攪拌機(jī)：上海理達(dá)儀器廠；LGJ-12冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.4方法

1.4.1PPO的提取

勻漿后丙酮抽提法［6］：稱取果肉60 g，采用勻漿法中提取酶液的方法提取酶液，并加入1.6倍體積的冷丙酮，離心10min，取沉淀，用濃度為0.2mmol/L的緩沖液再溶解，再離心10min，取上清液，用濾膜過濾，用聚乙二醇濃縮至20mL，冷凍干燥成粉，備用。

1.4.2溶液的配制

1.4.2.1緩沖液的配制

配制磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖液（pH3.0～7.4），Tris-鹽酸緩沖液（pH8.2～8.9），硼砂-氫氧化鈉緩沖液（pH9.3～9.8），磷酸一氫鈉和磷酸氫二鈉緩沖液（pH7.3 20mmol/L）備用［7］。

1.4.2.2酶液的配制

酶液1：將0.2 g已干燥的酶粉用100mL、pH7.3、20mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解，濾膜過濾后備用。

酶液2：將0.01 g酶粉用5mL不同pH的緩沖液溶解，濾膜過濾后備用。

1.4.2.3底物的配制

取一定量的沒食子酸、表兒茶酚、兒茶酚、綠原酸、咖啡酸，分別溶于100mL、pH7.3、20mmol/L磷酸緩沖液中，稀釋成0.005mol/L，備用。

1.4.2.4不同金屬離子緩沖液的配制

取一定量的無水亞硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硝酸鎂，分別溶于100mL、pH7.3、20mmol/L磷酸緩沖液中，濃度為0.1mol/L［8］。

1.4.3蘋果梨中多酚氧化酶的性質(zhì)測(cè)定

1.4.3.1PPO最適pH值的測(cè)定

比色皿中整個(gè)體系為3mL，體系中加入2.4mL不同pH值的緩沖液，0.2mL兒茶酚，0.4mL已配制的酶液1，混勻。利用紫外分光光度計(jì)在420 nm的波長下測(cè)定其活力。計(jì)時(shí)1min，記錄開始和結(jié)束時(shí)的吸光度值。在測(cè)定條件下，吸光度每變化0.001個(gè)單位定義為一個(gè)酶活［9］。

1.4.3.2PPO在不同pH值緩沖液中穩(wěn)定性的測(cè)定

取酶液2，測(cè)其在不同pH值緩沖液中的活力。

1.4.3.3PPO在不同底物濃度中的測(cè)定

取酶液1，測(cè)其在不同底物不同濃度下的活力。

1.4.3.4PPO在不同金屬離子中的測(cè)定

取酶液1，測(cè)其在不同金屬離子緩沖液中的活力［10］。

1.4.3.5蘋果梨中酚類物質(zhì)的定性研究

樣品處理：取蘋果梨果肉50 g，加入150mL無水乙醇勻漿，勻漿后用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲粉碎30 min，4℃下3 000 r/min冷凍離心，去沉淀留上清。將所得上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至20mL，0.45μm濾膜過濾后放入4℃保存，待測(cè)［11］。

蘋果梨中多酚類物質(zhì)的測(cè)定：采用液相色譜法，色譜條件為：A液為甲醇，B相為含1％冰醋酸的超純水，柱溫30℃，流速0.4mL/min，檢測(cè)波長為280 nm，進(jìn)樣量為5μL［12］。

2　結(jié)果與討論

2.1PPO最適pH值的確定

pH值對(duì)PPO活力的影響見圖1。

圖1　pH值對(duì)PPO活力的影響Fig.1 Effectsof pH on activity of PPO

從圖1中可以看出，蘋果梨的酶活在pH=5.0和pH=7.8時(shí)都出現(xiàn)了較大的波峰，但在7.8時(shí)酶活力最大。蘋果梨中PPO的最適pH值為7.8，當(dāng)pH值低于5.0或高于7.8時(shí)，PPO的活性下降而且下降很快，但pH5.0～6.6其活性變化較不穩(wěn)定，當(dāng)pH＜4.2和pH＞9.3，PPO的活性幾乎為0。這主要是因?yàn)樘O果梨PPO是一種含銅的蛋白質(zhì)，其作用機(jī)制在于氧化還原作用［13］。當(dāng)pH值較低時(shí)，一方面，酶中的銅被解離出來，使酶失活；另一方面，酸性較低，蛋白質(zhì)變性也使酶失活，堿性環(huán)境下銅與酶蛋白脫離，生成不溶性Cu（OH）2，也會(huì)使酶失活［14-15］。因此加工過程中調(diào)整pH值可減少褐變的發(fā)生。

2.2PPO在不同pH值緩沖液中的穩(wěn)定性

pH值對(duì)PPO穩(wěn)定性的影響見圖2。

圖2　pH值對(duì)PPO穩(wěn)定性的影響Fig.2 Impactof pH valueon thestability of PPO

從圖2中可以看出，PPO在pH=7.4時(shí)活力最高，下降趨勢(shì)最不明顯，在pH5.8～7.8，PPO活力隨時(shí)間的延長變化不大，但pH＜5.8或pH＞7.8時(shí)，時(shí)間越長，PPO活力越低。說明PPO在pH=7.4的環(huán)境中最穩(wěn)定性，在pH5.8～7.8的環(huán)境中也很穩(wěn)定，在pH＜5.8和pH＞7.8的環(huán)境中不穩(wěn)定。PPO浸泡在不適當(dāng)?shù)耐猸h(huán)境中時(shí)間越長，活力越低。并且可以看出PPO的活力在過酸或過堿條件下都得到有效抑制，而且時(shí)間越長對(duì)其抑制能力越強(qiáng)。

2.3不同底物濃度對(duì)PPO活力的影響

不同底物濃度對(duì)PPO的影響見圖3，濃度為0.3 mmol/L的不同底物對(duì)PPO活力的影響見圖4。

圖3　不同底物濃度對(duì)PPO的影響Fig.3 Influenceof different substrate concentration on the PPO

圖4　濃度為0.3mm ol/L的不同底物對(duì)PPO活力的影響Fig.4 Influenceof different substrateson PPO activity when the concentration was0.3mmol/L

從圖3中可以看出，在較低濃度范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，PPO的活力增加，當(dāng)表兒茶酚、綠原酸、兒茶酚濃度達(dá)到3mmol/L時(shí)，PPO的活力達(dá)到最大值，高于該濃度時(shí)，活力反而下降?？Х人岷蜎]食子酸在0.3mmol/L～4mmol/L時(shí)酶活力始終不變，并且接近于0。從圖4中可以看出，在相同濃度相同條件下，表兒茶酚的酶活力最高。當(dāng)?shù)孜餄舛仍诘头秶鷥?nèi)，隨著濃度的增加，PPO保持較高活性；底物濃度繼續(xù)增加，PPO活性達(dá)到一個(gè)極限后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是高濃度底物PPO活性起了抑制作用的結(jié)果，可能由于反應(yīng)產(chǎn)物的積累會(huì)抑制酶活［16］。底物濃度在極低范圍內(nèi)，底物濃度增加，不影響酶的活性，只有當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值時(shí)，才會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。在所用的各種底物中親和力的順序如下：表兒茶酚＞兒茶酚＞綠原酸＞咖啡酸＞沒食子酸。表兒茶酚對(duì)PPO的親和力最強(qiáng)，它在極低濃度時(shí)就能使PPO顯示較高活性。沒食子酸在低濃度下幾乎無PPO活性產(chǎn)生。

2.4PPO在不同金屬離子中的酶活

Mg2+、Na+、Al3+和K+等金屬離子對(duì)PPO的活性有抑制作用［17-18］，見圖5。

圖5　金屬離子對(duì)PPO的影響Fig.5 Effectsofmetal ion on PPO

從圖5中可以看出，在鈉離子中，PPO的活力最高；而在鋁離子中PPO的活力最低；在鎂離子和鉀離子中，PPO的活力相差不大。蘋果梨中的PPO在不同的金屬離子溶液中，其活性也各不相同。其活性大?。篘a+＞Mg2+＞K+＞Al3+。在鈉離子的溶液中，PPO表現(xiàn)出較大的活性，在鋁離子中，PPO的活性受到較大抑制。以鈉離子中的吸光值為對(duì)照，其它離子中的吸光值所占鈉離子的比值為：（所測(cè)離子中的吸光值/鈉離子中的吸光值）×100％。

2.5蘋果梨中酚類物質(zhì)的定性研究

根據(jù)HPCL法，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液和樣品進(jìn)行測(cè)定得到圖6和圖7。

圖6　標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.6 Chromatogram of standards

圖7　蘋果梨果肉中酚類物質(zhì)色譜圖Fig.7 Chrom atogram sof phenolics in the the flesh of apple pears

由圖6和圖7可知，蘋果梨果肉中檢測(cè)到的酚類物質(zhì)有兒茶素、綠原酸、表兒茶素和槲皮素等，其中含量最多的是綠原酸，其次含量較高的有兒茶素和槲皮素，其余含量很低。

3　結(jié)論

PPO的最適pH值為7.8，PPO在pH為7.4時(shí)最穩(wěn)定，pH5.8～7.8時(shí)很穩(wěn)定，pH＜5.8和pH＞7.8不穩(wěn)定，且時(shí)間越長PPO的活力越低；底物濃度在極低范圍內(nèi)，底物濃度增加，不影響酶的活性，當(dāng)?shù)孜餄舛仍诘头秶鷥?nèi)，隨著濃度的增加，PPO活性增加，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?mmol/L時(shí)，隨著濃度的增加，PPO活性反而下降；表兒茶酚和PPO的親和力最高；蘋果梨果肉中可檢測(cè)到的酚類物質(zhì)有兒茶素、綠原酸、表兒茶素和槲皮素等，其中含量最多的是綠原酸，其次含量較高的有兒茶素和槲皮素，其余含量很低。

［1］賀立紅，賓金華.高等植物中的多酚氧化酶［J］.植物生理學(xué)通訊，2001，37（4）：340-345

［2］魏送送.混濁梨汁酶促褐變機(jī)理及控制技術(shù)研究［D］.西安：陜西科技大學(xué)，2014

［3］Fulcrand H，Cheminat A，Brouillard R，et al.Characterization of compoundsobtained by chemical oxidation of caffeic acid in acidic conditions［J］.Phytochemistry，1994，35（2）：499-505

［4］劉亮，王如坤，程慧媛，等.水蜜桃多酚氧化酶分離純化及其酶學(xué)特性研究［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，29（6）：1121-1128

［5］許傳俊，李玲.植物多酚氧化酶研究進(jìn)展［J］.2002，6（1）：45-55

［6］戴亞，施春華，唐宏，等.煙草多酚氧化酶分離提純及性質(zhì)研究［J］.中國煙草學(xué)報(bào)，2001，7（4）：7-12

［7］黃建韶，張洪，田宏現(xiàn).蘋果中多酚氧化酶的性質(zhì)［J］.食品與機(jī)械，2001，22（3）：21-22

［8］王璋.食品酶學(xué)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1996：86-92

［9］易建華，李美利，朱振寶.蘋果多酚對(duì)多酚氧化酶氧化特性的影響［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29（11）：2601-2606

［10］劉樹文，陳錦屏，王仲孚.菊芋多酚氧化酶性質(zhì)的研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，1998（6）：11-13

［11］Amiot M J，Jachini M，AubertS，et al.Phenolic composition and browning susceptibility of various apple cultivars at maturity［J］. Food Sci，1992，57（4）：958-962

［12］Bengoechen M L，Sancho A，Bantolome B，etal.Phenolic composition of industrially manufactured process and concentrates from peach and apple fruites［J］.Afric Food Chem，1997，45（10）：4071-4075

［13］羅玲.天然果蔬多酚氧化酶氧化茶多酚的研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2014

［14］曲留柱.香蕉多酚氧化酶特性及其催化褐變防控的研究［D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2014

［15］劉軍偉，胡志和，蘇瑩.紫薯中多酚氧化酶活性的研究及褐變控制［J］.食品科學(xué)，2012（17）：207-211

［16］王磊，阮征，駱成堯，等.馬鈴薯多酚氧化酶酶學(xué)特性及熱穩(wěn)定性模型的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（19）：92-96

［17］王麗璞，郁軍，岳鵬翔，等.不同金屬離子對(duì)多酚氧化酶的影響［J］.食品科學(xué)，2011（13）：244-247

［18］林慶同，王偉，楊美花，等.金屬離子對(duì)馬鈴薯多酚氧化酶活力的影響［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，49（4）：561-563

Characterization of Polyphenol Oxidase and Composition of Polyphenols in Apple Pear

QUAN Wu-rong1，KANG You2，SHEN Ming-hao3，*
（1.Agricultural College，Yanbian University，Longjing 133400，Jilin，China；2.Changchun Food and Drug Administration，Changchun 130051，Jilin，China；3.College of Food Scienceand Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China）

With apple pears of polyphenol oxidase（PPO）as the research object，the characterization of polyphenoloxidaseand composition ofpolyphenolswere studied.Using spectrophotometricmethod to determine the enzyme activity，the qualitative ofphenolic in apple pearswas determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.PPO enzymeactivity reached the topwhen pH was7.8，andwhen pH was7.4 enzymeactivity declined notobviously，when the concentration of substratewasmore than 3mmol/L the activity of PPOwas decreasedwith the concentration ofsubstrate increased，enzyme activity reached the top when the substratewas epicatechin.Catechol，chlorogenic acid，epicatechin andmeletin could be detected in the flesh of apple pear by polyphenolsby high performance liquid chromatography（HPLC）.The resultsshowed that theoptimum pH of PPOwas7.8，when pH was7.4，the stability of PPOwas the strongest，PPO had the bestaffinitywith epicatechol，among the total，the contentsofchlorogenic acidwashighest，the catecholandmeletinwassecond.

applepear；polyphenoloxidase；highperformance liquid；qualitayive；content

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.006

權(quán)伍榮（1961—），男（朝鮮），教授，博士，研究方向：食品工程、食品安全。

沈明浩（1963—），男（朝鮮），教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：食品毒理與安全，胚胎毒理。

2015-10-23