張小蓮，王乃群，羅 立

（宜春市人民醫(yī)院，江西宜春336000）

間接免疫熒光法和歐蒙印跡法檢測抗雙鏈DNA抗體的比較

張小蓮，王乃群，羅 立

（宜春市人民醫(yī)院，江西宜春336000）

目的比較間接免疫熒光法和歐蒙印跡法檢測抗雙鏈抗體的陽性率及特點(diǎn)。方法采用間接免疫熒光法和歐蒙印跡法對240例患者血清標(biāo)本進(jìn)行抗dsDNA抗體的檢測（其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者80例，非系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者160例）。結(jié)果經(jīng)間接免疫熒光法檢測，SLE中抗dsDNA抗體陽性為28例，陽性率為35.00%（28/80），非SLE中抗dsDNA抗體陽性為1例，陽性率為0.625%（1/160）；經(jīng)歐蒙印跡法法檢測，SLE中抗dsDNA抗體陽性為41例，陽性率為51.25%（41/80），非SLE中抗dsDNA抗體陽性為2例，陽性率為1.25%（2/160）。兩種方法檢出的陽性率在SLE組做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論在SLE患者的診斷中，歐蒙印跡法抗dsDNA陽性的敏感性高于間接免疫熒光法抗dsDNA陽性。

間接免疫熒光法；免疫印跡法；抗dsDNA抗體；系統(tǒng)性紅斑狼瘡

抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者的特異性標(biāo)志抗體［1，2］，在SLE的發(fā)病中起重要作用，抗體與dsDNA結(jié)合形成的免疫復(fù)合物可存留在循環(huán)中或沉積在組織局部，后者激活補(bǔ)體導(dǎo)致組織炎癥性損害，引起SLE?？筪sDNA抗體對SLE的診斷具有很高的特異性，其抗體滴度與疾病活動(dòng)度存在相關(guān)性［3，4］，抗體滴度高提示SLE處于活動(dòng)期。抗dsDNA抗體檢測是目前SLE患者診斷及治療最常用的指標(biāo)之一［5］。本文采用分別間接免疫熒光法和歐蒙印跡法檢測抗dsDNA抗體，并對這兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集在我院就診的風(fēng)濕免疫病患者240例，包括SLE患者80例和非SLE患者160例，SLE的診斷符合1982年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。標(biāo)本采集：抽取靜脈血3ml，分離血清置-20℃冰箱備檢。在同一工作日，用兩種不同方法進(jìn)行檢測。

1.2 試劑與儀器抗雙鏈DNA抗體（IgG）間接免疫熒光法試劑盒（30T），抗核抗體譜（IgG）歐蒙印跡法試劑盒（64T）均購自德國歐蒙公司；熒光顯微鏡（ECLIPSE80i）購自日本Nikon公司；轉(zhuǎn)移脫色搖床（TS-8型）購自江蘇其林貝爾公司。

1.3 方法分別采用間接免疫熒光法和歐蒙印跡法對實(shí)驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行抗dsDNA抗體的檢測，兩種方法嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.31 間接免疫熒光法法采用歐蒙綠蠅短膜蟲間接免疫熒光檢測試劑盒進(jìn)行檢測，將血清按1：10稀釋，嚴(yán)格按試劑盒使用說明書操作，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，綠蠅短膜蟲動(dòng)基體均質(zhì)的或邊緣亮度增強(qiáng)的判為陽性，如果陰性，則動(dòng)基體不顯示熒光。

1.3.2 歐蒙印跡法采用歐蒙抗核抗體譜檢測試劑盒進(jìn)行檢測，將血清按1：101稀釋，嚴(yán)格按試劑使用說明書操作，每份標(biāo)本檢測抗dsDNA的IgG抗體，當(dāng)質(zhì)控帶出現(xiàn)時(shí)，包被dsDNA純抗原位置呈現(xiàn)一條深色條帶為陽性，反之為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對患者資料進(jìn)行分析，采用計(jì)數(shù)資料卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

SLE組與非SLE組結(jié)果見表1。對80例SLE組患者進(jìn)行抗dsDNA抗體檢測，間接免疫熒光法檢出陽性28例，陽性率為35.00%（28/80）；歐蒙印跡法檢出41例，陽性率為51.25%（41/80），2種方法陽性率有顯著性差異（P＜0.05）。SLE組中間接免疫熒光法檢測陽性患者，用歐蒙印跡法法檢測也為陽性。對160例非SLE組患者進(jìn)行抗dsDNA抗體檢測，間接免疫熒光法檢出陽性1例，陽性率為0.625%（1/160）；歐蒙印跡法法檢出陽性2例，陽性率為1.25%（2/160），2種方法陽性率無顯著性差異（P＞0.05）。非SLE組中兩種方法檢測均陽性的有1例，歐蒙印跡膜條技術(shù)陽性而間接免疫熒光法檢測陰性的有1例，這兩例患者臨床表現(xiàn)不符合SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)2002年干燥綜合征國際分類標(biāo)準(zhǔn)診斷，這兩例患者臨床表現(xiàn)均符合SS的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 SLE組與非SLE組中間接免疫熒光法與歐蒙印跡法檢測抗dsDNA的比較［n（%）］

3 討論

抗dsDNA抗體是診斷SLE的標(biāo)志性抗體，美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)已將其列為SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。正確判斷抗dsDNA抗體的結(jié)果非常重要［7］。間接免疫熒光法檢測抗dsDNA抗體的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)是血鞭毛蟲屬的綠蠅短膜蟲作為抗原基質(zhì)進(jìn)行檢測的，它有一個(gè)大的含有dsDNA的線粒體（動(dòng)基體），除dsDNA之外，通常不含有其他細(xì)胞核抗原，因而與動(dòng)基體起反應(yīng)的自身抗體只是dsDNA，具有高度特異性，被認(rèn)為是檢測細(xì)胞內(nèi)抗原自身抗體的金標(biāo)準(zhǔn)［8，9］，是一種較好的確證方法。此方法還可以檢測陽性標(biāo)本的滴度，為患者療效監(jiān)控提供有效的依據(jù)。但I(xiàn)IF結(jié)果的判斷有一定的主觀性，易受檢測人員技術(shù)水平及主觀因素影響，需要操作者有嫻熟的形態(tài)學(xué)技術(shù)及豐富的經(jīng)驗(yàn)，且熒光顯微鏡價(jià)格昂貴，基層醫(yī)院難以開展［10，11］。歐蒙印跡法檢測抗dsDNA抗體將天然的dsDNA抗原經(jīng)親和層析純化后包被在膜條的固定位置上，稀釋血清的抗dsDNA抗體與膜條上的抗原結(jié)合，結(jié)合的抗體與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG抗體反應(yīng)，加入底物液使已結(jié)合的抗體顯色，呈現(xiàn)一條深色的陽性帶。結(jié)果肉眼觀察、特異性強(qiáng)，敏感性高，膜條結(jié)果可長期保存，且操作簡便，用血量少，無需特殊設(shè)備，可同時(shí)完成對11種自身抗體的識(shí)別和過篩，對提高自身免疫疾病的診斷水平有很大的幫助，適合于各大醫(yī)院推廣應(yīng)用，但是對臨界陽性的標(biāo)本不同操作者對結(jié)果的判斷不盡相同，很容易造成誤判或假陽性，印跡技術(shù)在生產(chǎn)過程中可能會(huì)發(fā)生抗原轉(zhuǎn)印不充分或丟失，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果［12-14］。且膜條結(jié)果判讀抗雙鏈DNA時(shí)有些情況需要注意，如該抗體單獨(dú)出現(xiàn)時(shí)不能報(bào)，為非特異性反應(yīng)。如果單獨(dú)出現(xiàn)時(shí)也記為非特異性反應(yīng)，就會(huì)在一定程度上導(dǎo)致陽性率增高［15］。本研究中13例患者經(jīng)間接免疫熒光法檢測呈陰性，而經(jīng)歐蒙印跡法檢測呈陽性，其主要是由于間接免疫熒光法的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)為綠蠅短膜蟲，其只含有一個(gè)dsDNA不含其它細(xì)胞核抗原，其雖具有較高的特異性，然而該檢測方式較易受檢測人員主觀因素的影響，且在制備過程中DNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)位點(diǎn)可能少部分人為暴露，進(jìn)而可能會(huì)因抗ssDNA抗體的存在而引發(fā)非特異性反應(yīng)，對檢測結(jié)果的影響較大，產(chǎn)生假陽性；另外，該檢測方法需采用熒光纖維設(shè)備，故而難以在基層醫(yī)院推廣。

本文通過上述兩種檢測抗dsDNA抗體的方法比較，兩種方法檢出的陽性率在SLE組做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，有明顯差異（P＜0．05），歐蒙印跡法檢測的陽性率明顯高于間接免疫熒光法檢測的陽性率。兩種方法在檢測SLE組與非SLE組的陽性率做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，有顯著差異（P＜0.01），SLE組明顯高于非SLE組，驗(yàn)證了抗dsDNA抗體在SLE的診斷中的意義。綜上討論，兩種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)際情況選擇檢測方法，并結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)來判斷結(jié)果。

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R446.62，R593.21

A

1674-1129（2016）05-0642-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.035

2016-02-29；

2016-05-04）