卞兆連　秦剛　陳琳　邵建國　苗琪　馬雄

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·論著·

穿入現(xiàn)象在自身免疫性肝炎中的臨床意義

卞兆連秦剛陳琳邵建國苗琪馬雄

目的研究自身免疫性肝炎(Autoimmnue hepatitis, AIH)中發(fā)生穿入現(xiàn)象的概況以及其臨床意義。方法H&E染色后在顯微鏡下觀察，AIH患者肝組織是否存在細(xì)胞穿入現(xiàn)象；通過Ishak評分系統(tǒng)對每一例AIH患者肝內(nèi)炎癥及纖維化評分，并對每例患者行界面性肝炎、漿細(xì)胞浸潤以及玫瑰花結(jié)等情況的評估；隨后，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析AIH患者肝組織中發(fā)生穿入現(xiàn)象的比例，并分析穿入現(xiàn)象與肝內(nèi)炎癥及纖維化的關(guān)系以及與AIH特征性病理表現(xiàn)之間的關(guān)系。結(jié)果57.3% AIH患者肝組織中發(fā)現(xiàn)穿入現(xiàn)象，穿入現(xiàn)象發(fā)生后宿主肝細(xì)胞嗜伊紅染色；隨著AIH患者肝內(nèi)炎癥及纖維化的加重，穿入現(xiàn)象的發(fā)生比例逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；發(fā)生穿入現(xiàn)象的AIH患者肝內(nèi)界面性肝炎較無穿入組明顯加重，同樣在發(fā)生穿入組患者肝內(nèi)玫瑰花結(jié)的發(fā)生率增加，而與漿細(xì)胞浸潤無明顯相關(guān)性。結(jié)論穿入現(xiàn)象可能是診斷AIH的重要病理學(xué)特征，并可能是AIH患者肝細(xì)胞損傷的機(jī)制。

穿入現(xiàn)象；自身免疫性肝炎；界面性肝炎；玫瑰花結(jié)

自身免疫性肝炎(Autoimmnue hepatitis, AIH)臨床表現(xiàn)為不同程度的肝功能損傷，主要以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)升高為主，血清自身抗體陽性，高免疫球蛋白G和(或)γ-球蛋白血癥，隨著疾病不斷發(fā)展，可進(jìn)展為肝硬化、肝功能衰竭等終末期肝病，嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生活質(zhì)量。AIH的臨床表現(xiàn)多種多樣，一般表現(xiàn)為慢性、隱匿性起病，但也可表現(xiàn)為急性發(fā)作，甚至表現(xiàn)為急性肝功能衰竭。AIH的病理學(xué)特征表現(xiàn)主要包括中-重度界面性肝炎、玫瑰花結(jié)以及淋巴-漿細(xì)胞浸潤。2015年我國《自身免疫性肝炎診治專家共識(shí)》提出穿入現(xiàn)象是繼上述三種特征性病理改變之后的另一種特征性的病理表現(xiàn)，對AIH的診斷及鑒別診斷有重要價(jià)值[1]。穿入現(xiàn)象，于1956年由Humble等首次提出，是指一個(gè)活細(xì)胞進(jìn)入另一個(gè)活細(xì)胞的現(xiàn)象；與傳統(tǒng)的“吞噬”概念明顯不同，穿入是發(fā)生在兩個(gè)活細(xì)胞之間，而吞噬是指吞噬已經(jīng)死亡的細(xì)胞或其碎片的生理過程[2]。目前研究顯示，穿入可發(fā)生于腫瘤細(xì)胞之間、免疫細(xì)胞與腫瘤之間或者免疫細(xì)胞和正常細(xì)胞之間[3]。Sandilands等[4]研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞可穿入體外培養(yǎng)的人肝細(xì)胞，后續(xù)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)穿入現(xiàn)象可見于自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、病毒性肝炎等[5-7]。2008年AIH簡化診斷標(biāo)準(zhǔn)中將細(xì)胞穿入現(xiàn)象作為AIH組織學(xué)表現(xiàn)之一[6，8]，2015年我國《自身免疫性肝炎診治專家共識(shí)》也提出穿入現(xiàn)象在AIH診斷及鑒別診斷中的價(jià)值，揭示了穿入現(xiàn)象在AIH中的重要地位，但穿入現(xiàn)象在AIH中的臨床意義及價(jià)值仍不明確。本研究致力于闡述AIH中，細(xì)胞穿入現(xiàn)象的臨床價(jià)值及意義。

資料和方法

一、標(biāo)本來源和主要試劑

收集2008年至2015年在南通市第三人民醫(yī)院及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，行肝穿刺組織病理學(xué)檢查的AIH患者，共計(jì)75例，其中男性12例，女63例。AIH的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1999年修訂的自身免疫性肝炎積分系統(tǒng)，所有患者均為確定性診斷，評分≥18分。蘇木素染色液及伊紅染液購自上海研域化學(xué)試劑有限公司。

二、蘇木素-伊紅染色法

肝穿刺標(biāo)本經(jīng)過4%甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片至4 μm厚；常規(guī)脫蠟水化，隨后經(jīng)過蘇木素染色液及伊紅染液浸染，透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料使用n(%)表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Graphpad prism 6行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、自身免疫性肝炎患者肝組織病理情況分析

共收集75例AIH患者，其中男性12例，女性63例，男女發(fā)病率近1:6，平均發(fā)病年齡49.7歲。對肝穿刺活檢病理組織行Ishak評分系統(tǒng)評分。根據(jù)炎癥評分高低將患者分為3個(gè)等級,分別為<6分、6～12分以及>12分。<6分27例，6～12分4例，>12分7例。根據(jù)纖維化程度不同將患者分為2個(gè)等級，≤2分以及≥3分，分別為34和41例患者。

二、AIH患者中主要以淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞為主

在AIH患者肝組織中，細(xì)胞穿入主要是發(fā)生在淋巴細(xì)胞與肝細(xì)胞之間，被淋巴細(xì)胞穿入的肝細(xì)胞胞質(zhì)嗜伊紅染色，提示肝細(xì)胞可能進(jìn)入凋亡前期，即將發(fā)生細(xì)胞凋亡(圖1)。75例AIH患者中43例(57.3%)發(fā)生淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞，提示淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞現(xiàn)象在AIH中較為常見。

AIH患者穿入現(xiàn)象

三、自身免疫性肝炎中，淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞的臨床意義

75例AIH患者中Ishak評分<6分共27例，8例(29.6%)發(fā)生淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞；6～12分共41例患者，28例(68.3%)發(fā)現(xiàn)穿入現(xiàn)象；>12分共7例，肝組織中均發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞現(xiàn)象，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果提示在AIH患者中，隨著肝內(nèi)炎癥逐漸加重，淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞的發(fā)生比率也明顯增加。進(jìn)一步分析肝纖維化與穿入現(xiàn)象之間的關(guān)系。根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)將AIH患者分為輕度纖維化及明顯纖維化兩組，≤2分為輕度纖維化組，不會(huì)出現(xiàn)P-P纖維橋接；而≥3分時(shí)視為明顯纖維化組，肝內(nèi)至少出現(xiàn)P-P纖維橋接，甚至出現(xiàn)肝硬化等嚴(yán)重改變。結(jié)果顯示34例輕度肝纖維化患者中，12例(35.3%)肝組織內(nèi)發(fā)生淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞現(xiàn)象；而41例明顯肝纖維化患者組中，31例(75.6%)發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞現(xiàn)象，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

四、穿入現(xiàn)象與界面性肝炎、玫瑰花結(jié)、漿細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系

AIH特征性的病理學(xué)改變主要包括界面性肝炎、玫瑰花結(jié)以及漿細(xì)胞浸潤三個(gè)方面。2008年國際自身免疫性肝炎小組制定的簡化標(biāo)準(zhǔn)中提及穿入現(xiàn)象是AIH的表現(xiàn)之一，那么它與傳統(tǒng)的AIH病理學(xué)特征之間是否存在相關(guān)呢？將所有AIH患者分為二組，分為無穿入現(xiàn)象組(n=32)及有穿入現(xiàn)象組(n=43)，結(jié)果顯示在無穿入組患者中肝內(nèi)界面性肝炎(0.91±0.34)相對較輕，而在有穿入現(xiàn)象組肝內(nèi)界面性肝炎明顯加重(1.84±0.27)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；分析兩組患者間漿細(xì)胞浸潤是否存在差異，未發(fā)現(xiàn)穿入組患者中30例(93.8%)發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞，而穿入組中42例(97.7)發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組間漿細(xì)胞浸潤無差異(P>0.05)；進(jìn)一步分析有無穿入現(xiàn)象組間玫瑰花結(jié)發(fā)現(xiàn)率是否存在差異，結(jié)果顯示無穿入組中4例(12.5%)發(fā)現(xiàn)玫瑰花結(jié)，而穿入組患者中11例(25.6%)發(fā)現(xiàn)玫瑰花結(jié)，結(jié)果分析顯示兩組患者肝組織中玫瑰花結(jié)發(fā)現(xiàn)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

討　　論

1925年，Lewis首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞的現(xiàn)象，并將其定義為一個(gè)活細(xì)胞自發(fā)進(jìn)入另一個(gè)活細(xì)胞的現(xiàn)象[9]，其與傳統(tǒng)的“吞噬”概念完全不同，主要表現(xiàn)在以下二個(gè)方面，①發(fā)生的主題不同：穿入發(fā)生在兩個(gè)活細(xì)胞間，而吞噬發(fā)生在活細(xì)胞與凋亡細(xì)胞/細(xì)胞碎片之間；②結(jié)局不相同：發(fā)生穿入的細(xì)胞仍能存活一段時(shí)間，可發(fā)生分裂，甚至可從宿主細(xì)胞中“逃脫”，而吞噬的結(jié)局是以消除凋亡細(xì)胞或細(xì)胞碎片為最終的結(jié)局[3]。目前研究顯示，細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞現(xiàn)象可以發(fā)生在多種類型細(xì)胞之間，而根據(jù)細(xì)胞類型的不同，分為兩大類：①Emperipolesis(穿入)指兩種不同細(xì)胞間的相互作用，如免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間；② Entosis主要適用于同種細(xì)胞之間，如腫瘤細(xì)胞之間。Emperipolesis這一概念是由Humble等[2]在研究淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞相互作用的過程中提出的。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞可穿入多種類型的細(xì)胞，如：巨核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞等[10-12]。早在1978年，Sandilands等[4]報(bào)道了穿入現(xiàn)象在肝臟方面的研究，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞可穿入正常人肝臟細(xì)胞(張氏肝細(xì)胞)。最近研究發(fā)現(xiàn)，其他種類的淋巴細(xì)胞系也可穿入肝細(xì)胞，如人T淋巴瘤細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞等[13]。在多種疾病中也存在穿入現(xiàn)象，例如自身免疫性貧血、實(shí)體腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病等[10，14，15]。穿入現(xiàn)象是肝臟炎癥性疾病的一個(gè)重要病理學(xué)特征，在疾病的診斷及鑒別診斷方面具有一定的參考價(jià)值，在多種肝臟炎癥性疾病如AIH、病毒性肝炎和藥物性肝損傷中均可發(fā)生[5-7]，其中AIH的發(fā)現(xiàn)率明顯高于其他肝臟炎癥性疾病，提示穿入現(xiàn)象在AIH的診斷中有一定的價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，57.3%的AIH患者肝組織中有淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞現(xiàn)象，提示淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞是重要的病理學(xué)特征，可能是繼玫瑰花結(jié)、漿細(xì)胞浸潤、界面性肝炎之后成為AIH特征性的病理改變，在AIH的診斷及鑒別診斷中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在AIH中，發(fā)生穿入現(xiàn)象的宿主肝細(xì)胞胞質(zhì)嗜伊紅染色，提示宿主肝細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生早期凋亡，這可能是AIH患者肝組織中肝細(xì)胞損害的機(jī)制之一。

目前認(rèn)為，AIH發(fā)病基礎(chǔ)是機(jī)體免疫耐受被打破，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在肝臟局部聚集，造成器官特異的自身免疫性肝損害，而肝細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞[16]。在AIH發(fā)病過程中，CD8、CD4陽性T細(xì)胞、漿細(xì)胞以及單核/巨噬細(xì)胞在匯管區(qū)浸潤，引起界板處肝細(xì)胞損傷為主要特征[17]。白介素-17可通過促進(jìn)肝細(xì)胞分泌白介素-6等細(xì)胞因子參與AIH的發(fā)病機(jī)制[18]。最近研究發(fā)現(xiàn)，AIH患者肝組織中發(fā)生穿入的細(xì)胞主要是CD8陽性T細(xì)胞[19]，而CD8陽性T細(xì)胞是AIH中主要的效應(yīng)細(xì)胞，結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生穿入的宿主肝細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，提示穿入現(xiàn)象可能在AIH肝細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，AIH患者淋巴細(xì)胞穿入肝細(xì)胞較為常見，并且隨著肝內(nèi)炎癥的加重，穿入現(xiàn)象發(fā)生逐漸增加，提示穿入現(xiàn)象可能在AIH的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，穿入現(xiàn)象與界面性肝炎以及玫瑰花結(jié)的發(fā)生相關(guān)，隨著穿入現(xiàn)象的出現(xiàn)，界面性肝炎加重，玫瑰花結(jié)的發(fā)生率也增加，提示穿入現(xiàn)象可能是AIH重要的病理學(xué)特征，是AIH發(fā)病過程中肝細(xì)胞損害的重要機(jī)制之一。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì). 自身免疫性肝炎診斷和治療共識(shí)(2015). 肝臟，2015，24：969-982.

[2]Humble JG, Jayne WH, Pulvertaft RJ. Biological interaction between lymphocytes and other cells. Br J Haematol, 1956, 2: 283-294.

[3]Overholtzer M, Brugge JS. The cell biology of cell-in-cell structures. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9:796-809.

[4]Sandilands GP, Reid FM, Gray KG, et al. Lymphocyte emperipolesis revisited. I. Development of in vitro assay and preliminary characterisation of the lymphocyte subpopulation involved. Immunology, 1978, 35:381-389.

[5]Dienes HP. Viral and autoimmune hepatitis. Morphologic and pathogenetic aspects of cell damage in hepatitis with potential chronicity. Veroff Pathol, 1989, 132:1-107.

[6]Hennes EM, Zeniya M, Czaja AJ, et al. Simplified criteria for the diagnosis of autoimmune hepatitis. Hepatology, 2008, 48:169-176.

[7]Suzuki A, Brunt EM, Kleiner DE, et al. The use of liver biopsy evaluation in discrimination of idiopathic autoimmune hepatitis versus drug-induced liver injury. Hepatology, 2011, 54:931-939.

[8]Qiu D, Wang Q, Wang H, et al. Validation of the simplified criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis in Chinese patients. J Hepatol, 2011, 54:340-347.

[9]Yang YQ, Li JC. Progress of research in cell-in-cell phenomena. Anat Rec (Hoboken), 2012, 295:372-377.

[10]Larsen TE. Emperipolesis of granular leukocytes within megakaryocytes in human hemopoietic bone marrow. Am J Clin Pathol, 1970, 53:485-489.

[11]Sinkovics JG, Shullenberger CC, Howe C, et al. Cell destruction by lymphocytes. Lancet, 1966, 287:1215-1216.

[12]Saxena S, Beena KR, Bansal A, et al. Emperipolesis in a common breast malignancy. A case report. Acta Cytol, 2002, 46:883-886.

[13]Chen YH, Wang S, He MF, et al. Prevalence of heterotypic tumor/immune cell-in-cell structure in vitro and in vivo leading to formation of aneuploidy. PLoS One, 2013, 8:e59418.

[14]Natori H, Natori K, Naito K, et al. Emperipolesis by megakaryocytes in RAEB in T (refractory anemia with excess of blasts in transformation). Rinsho Ketsueki, 1988, 29:1504-1510.

[15]Djaldetti M, Strauss Z. Emperipolesis by megakaryocytes in patients with non-Hodgkin's lymphoma and megaloblastic anemia. J Submicrosc Cytol, 1982, 14:407-413.

[16]Weiler-Normann C, Lohse AW. Autoimmune hepatitis: A life-long disease. J Hepatol, 2013, 58:5-7.

[17]Longhi MS, Ma Y, Mieli-Vergani G, et al. Aetiopathogenesis of autoimmune hepatitis. J Autoimmun, 2010, 34:7-14.

[18]Zhao L, Tang Y, You Z, et al. Interleukin-17 contributes to the pathogenesis of autoimmune hepatitis through inducing hepatic interleukin-6 expression. PLoS One, 2011, 6:e18909.

[19]Miao Q, Bian Z, Tang R, et al. Emperipolesis Mediated by CD8 T Cells Is a Characteristic Histopathologic Feature of Autoimmune Hepatitis. Clin Rev Allergy Immunol, 2015, 48:226-235.

(本文編輯：錢燕)

Clinical significance of emperipolesis in autoimmune hepatitis

BIANZhao-lian,QINGang,CHENLin,SHAOJianguo,MIAOQi,MAXiong.

NantongThirdPeople'sHospital,NantongInstituteofLiverDisease, 99MiddleQingnianRoad,Jiangsu, 226006China. 2DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity，ShanghaiInstituteofDigestiveDisease,shanghai, 200001ChinaCorrespondingauthor:

ObjectiveTo investigate the incidence and clinic significance of emperipolesis in autoimmune hepatitis (AIH) patients in China. MethodsA histological evaluation by hematoxylin-eosin staining in all AIH patients was performed. Assessment of Ishak score was carried out for intrahepatic inflammation or fibrosis, as well as evaluation of interface hepatitis, plasma cell infiltration and rosette formation in the liver. Then the incidence of emperipolesis was analyzed statistically in patients with AIH. Furthermore, the relation of emperipolesis with intrahepatic inflammation or fibrosis and other pathological characteristics of AIH were analyzed. ResultsThe presence of emperipolesis was observed in 57.3% AIH cases which was with hepatocyte eosinophilic stained. The incidence of emperipolesis showed positive correlations with the aggravation of intrahepatic inflammation or fibrosis. Histologically, patients with emperipolesis had higher incidences of interface hepatitis and rosette formation as compared with patients without emperipolesis. ConclusionEmperipolesis might be an important pathological hallmark for AIH, which might even illustrate a novel mechanism of hepatocyte damage in AIH.

Emperipolesis; Autoimmune hepatitis; Interface hepatitis; Rosette

南通市科技局(MS22015105，HS2014061)；江蘇省衛(wèi)計(jì)委科技項(xiàng)目(H201453)

226006南通市第三人民醫(yī)院南通市肝病研究所(卞兆連，秦剛，陳琳，邵建國)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科上海市消化疾病研究所(苗琪，馬雄)

馬雄，Email：maxiongmd@163.com

2016-07-16)