章維，張苗尊，李明主，鄭必春，顧昕

Hedgehog通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli-1與Snail在肝膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

章維，張苗尊，李明主，鄭必春，顧昕

目的觀察膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白-1（Gli-1）和鋅指轉(zhuǎn)錄蛋白（Snail）在肝膽管細(xì)胞癌組織中的表達(dá)。方法應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)在20例正常肝膽管組織和52例肝膽管細(xì)胞癌組織中Gli-1蛋白和Snail蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果20例肝膽管細(xì)胞正常組織Gli-1陽(yáng)性表達(dá)3例（15%），Snail表達(dá)4例（20%）；52例肝膽管細(xì)胞癌組織中Gli-1陽(yáng)性表達(dá)40例（76.92%），Snail陽(yáng)性表達(dá)37例（71.15%）；癌旁組織分別為19例（36.53%）和17例（32.69%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）；Gli-1的表達(dá)與血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（＜0.05），Snail表達(dá)與分化程度、血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（＜0.05），Gli-1與Snail表達(dá)存在正相關(guān)性（＜0.05）。結(jié)論肝膽管細(xì)胞癌組織中Gli-1和Snail高度表達(dá)，且與血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明Hh信號(hào)通道和EMT異?？赡芘c肝膽管細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

癌；肝；膽；Gli-1；Snail；病理

肝膽管細(xì)胞癌（IHCC）發(fā)生于肝內(nèi)的膽管，發(fā)病隱匿，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其發(fā)生、發(fā)展涉及多條信號(hào)通路，發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白-1（Gli-1）作為Hedgehog通路中最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其與Hedgehog信號(hào)通路目的基因的啟動(dòng)子結(jié)合，直接調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。鋅指轉(zhuǎn)錄蛋白（Snail）是近年發(fā)現(xiàn)的鋅指轉(zhuǎn)錄蛋白，可下調(diào)E-cadherin表達(dá)，在多種惡性腫瘤中作為一種重要的預(yù)后因素。本研究通過(guò)測(cè)定Hh信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli-1及Snail的表達(dá)情況，并綜合患者臨床特征，從而探討Gli-1、Snail與膽管細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲的相關(guān)性及其臨床意義。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2009年1月至2014年12月寧波大學(xué)附屬鄞州醫(yī)院及寧波市第二醫(yī)院原發(fā)性IHCC患者標(biāo)本52例，所有患者均經(jīng)病理確診，另外收集正常肝組織標(biāo)本20例。52例IHCC標(biāo)本中，男25例，女27例；年齡36～73歲，平均63.2歲；合并乙型肝炎者15例，乙肝陰性者37例；根據(jù)病理學(xué)分級(jí)，其中中度分化29例，低度分化23例。根據(jù)有無(wú)門(mén)靜脈癌栓分為兩組（有12例，無(wú)40例），根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為兩組（有18例，無(wú)34例）。所有患者均未接受術(shù)后輔助治療（如化療、放療或其他治療），并且全部接受同種治療方案。自手術(shù)日起隨訪(fǎng)1至36個(gè)月（平均10.1個(gè)月）。

1.2 方法試劑：Gli-1兔多克隆IgG抗體（H-300）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔Snail多克隆IgG抗體購(gòu)自Abcam公司，SP試劑盒在北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司可以購(gòu)得，并提供試劑盒和基本操作方法。應(yīng)用免疫組化SP方法檢測(cè)Gli-1蛋白和Snail蛋白的表達(dá)。供體蠟塊常規(guī)切片，HE染色閱片后，選取病變典型部位，將52例患者標(biāo)本按癌組織/癌旁組織的順序制備成石蠟切片，以20例正常肝組織標(biāo)本為對(duì)照。檢測(cè)方法按試劑盒操作說(shuō)明，切片常規(guī)脫蠟、水化，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，37℃條件處理10min，經(jīng)Tris-EDTA抗原修復(fù)液中微波抗原修復(fù)15min，山羊血清封閉30min，一抗4℃過(guò)夜，生物素標(biāo)記的二抗37℃反應(yīng)30min，辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素37℃反應(yīng)30min，顯微鏡下控制DAB染色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及顯色深淺采用半定量積分法分級(jí)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：（1）陽(yáng)性細(xì)胞百分率：未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞者為0分；＜25%為1分；25%～75%為2分；＞75%為3分。（2）顯色深淺：不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以上2項(xiàng)相加最終評(píng)定結(jié)果，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（+），4～5分為中度陽(yáng)性（2+），＞5分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析癌組織、癌旁組織、正常肝組織的Gli-1與Snail蛋白的表達(dá)水平；采用2檢驗(yàn)檢測(cè)Gli-1與Snail表達(dá)與臨床資料的關(guān)系；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gli-1與Snail表達(dá)情況20例肝膽管細(xì)胞正常組織Gli-1陽(yáng)性表達(dá)3例（15%），Snail陽(yáng)性表達(dá)4例（20%）；52例肝膽管細(xì)胞癌組織中Gli-1陽(yáng)性表達(dá)40例（76.92%），Snail陽(yáng)性表達(dá)37例（71.15%），癌旁組織分別為19例（36.53%）和17例（32.69%）；膽管細(xì)胞癌組織、癌旁組織和膽管細(xì)胞正常組織的Gli-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和Snail蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 Gli-1、Snail表達(dá)與臨床資料

Gli-1的表達(dá)與肝膽管細(xì)胞癌的性別、年齡、肝硬化及分化程度無(wú)關(guān)（＞0.05），與血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)（＜0.05）；Snail的表達(dá)與肝膽管細(xì)胞癌的性別、年齡、肝硬化無(wú)關(guān)（＞0.05），與分化程度、血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 Gli-1與Snail的相關(guān)性52例膽管細(xì)胞癌中，Gli-1與Snail表達(dá)均陰性8例，均陽(yáng)性33例，Gli-1陽(yáng)性而Snail陰性7例，Snail表達(dá)陽(yáng)性Gli-1陰性4例，Gli-1與Snail表達(dá)存在正相關(guān)性（=0.457，＜0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

Hedgehog基因的發(fā)現(xiàn)源于對(duì)果蠅胚胎發(fā)育的研究，在人類(lèi)中，該通路的傳遞過(guò)程可以簡(jiǎn)單總結(jié)為Hedgehog-Ptchl-Smo-Gli過(guò)程。Gli-l作為Hedgehog通路中最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)調(diào)控該通路下游眾多效應(yīng)因子，其與Hedgehog信號(hào)通路中下游基因的啟動(dòng)子結(jié)合，直接調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明hedgehog通路在胃腸腫瘤中發(fā)生異?；罨?-4］。本研究發(fā)現(xiàn)Gli-1在肝膽管細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并與血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這表明Hh信號(hào)通路過(guò)度表達(dá)可能在肝膽管細(xì)胞癌血管侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移（EMT）多發(fā)生于胚胎細(xì)胞發(fā)育及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，且在慢性炎癥及纖維化疾病中扮演重要角色。EMT的重要特征是細(xì)胞間連接的斷裂、頂-基底極性轉(zhuǎn)為前后極性，從而獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力［5-6］。因此，EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的早期指標(biāo)，而E-cadherin的缺失是EMT的標(biāo)志，包括鋅指蛋白Snail/slug家族，Twist、ZEB1、SIP1、E12/E7等術(shù)中轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)與E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。其中Snail是E-cadherin最重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子，有研究發(fā)現(xiàn)Snail的表達(dá)水平與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后密切相關(guān)。Snail的表達(dá)在乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌及胃癌中均有上調(diào)［4，7-9］。本研究中Snail在肝膽管細(xì)胞組織中高表達(dá)，并且與腫瘤分化、血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。

有研究報(bào)道表明Hh信號(hào)通道與EMT之間有相關(guān)性。Ohta等［5］報(bào)道彌漫型胃癌組織中Gli-1可刺激SIP1轉(zhuǎn)錄，從而激活包括Twist和Snai2等EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，Hh信號(hào)通道和EMT過(guò)程在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程有密切聯(lián)系。Wang等［3］發(fā)現(xiàn)胃癌患者中Gli-1、Snail和E-cadherin異常表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，表明Hh信號(hào)通道和EMT可能影響胃癌預(yù)后，但通過(guò)多因素生存研究發(fā)現(xiàn)，Gli-1和Snail并不是預(yù)后獨(dú)立影響因素，考慮腫瘤發(fā)生發(fā)展可能是多基因多通道的一個(gè)過(guò)程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝膽管細(xì)胞癌中Gli-1和Snail的表達(dá)有相關(guān)性，且均與血管侵犯和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)肝膽管細(xì)胞癌組織中Gli-1和Snail高度表達(dá)，且與血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明Hh信號(hào)通道和EMT異常可能與肝膽管細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

表1 膽管細(xì)胞癌組織及癌旁組織、正常組織中Gli-1及Snail蛋白的表達(dá)情況

表2 Gli-1、Snail蛋白的表達(dá)與膽管細(xì)胞癌臨床病理的關(guān)系

表3 Gli-1與Snail蛋白的表達(dá)相關(guān)性例

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.03.027

R735；R446.6

A

1671-0800（2016）03-0332-03

2015-11-15

（本文編輯：陳志翔）

寧波市自然科學(xué)基金（2012A610198）

315010寧波，寧波市第二醫(yī)院（章維）；寧波大學(xué)附屬鄞州醫(yī)院（張苗尊、李明主、鄭必春、顧昕）

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