蔣海忠，孫萍胡，王布江，丁小云

胃癌細胞IL-33基因表達與化療藥物敏感性的相關性研究

蔣海忠，孫萍胡，王布江，丁小云

目的本研究旨在揭示胃癌細胞白介素-33（IL-33）基因表達對化療藥物敏感性的影響及其可能的作用機制。方法用Ad-IL-33-EGFP、Ad-EGFP腺病毒載體，分別感染MGC-803得到MGC-803-IL-33、MGC-803-Mock，加入順鉑培養(yǎng)48 h。應用MTT測細胞增殖，Western blot測caspase-3、PARP的蛋白表達，實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）測定ERCC1、BRCA1基因mRNA表達。結果MGC-803、MGC-803-Mock、MGC-803-IL-33細胞予順鉑處理，MTT結果顯示MGC-803-IL-33細胞增殖能力較MGC-803、MGC-803-Mock強（＜0.05），Westernblot結果示MGC-803-IL-33細胞caspase-3及PARP蛋白活化程度低（＜0.05），qRT-PCR測定示MGC-803-IL-33細胞ERCC1基因mRNA表達升高（＜0.05）。結論IL-33高表達導致腫瘤細胞對順鉑的敏感性下降，其機制可能是通過上調ERCC1基因的表達增強DNA損傷后的修復能力而產(chǎn)生耐藥。

胃腫瘤；癌；白介素-33；化療

近年來我國胃癌發(fā)病率雖有下降的趨勢［1］，但仍然明顯高于歐美國家，多數(shù)患者診斷時已處于進展期，因此病死率也居各類腫瘤前列。根治性手術是目前進展期胃癌患者首選治療手段，但5年生存率并不理想。因此美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡指南把胃癌術后的化療作為標準治療的Ⅰ類推薦，并且術前的新輔助化療也逐漸受到國內(nèi)外專家學者的重視。但是隨著臨床上腫瘤化療藥物的廣泛應用，腫瘤的耐藥性問題越來越突出，尤其是多重耐藥已成為腫瘤有效治療的主要障礙之一［2］，這也是導致術后標準治療方法的5年生存率仍然＜50%的主要原因［3］。因此，研究胃癌細胞化療耐藥機制為臨床治療提供理論依據(jù)就顯得尤為重要。白介素（IL）-33是白細胞介素家族的新成員［4］，對于IL-33的研究主要集中在哮喘［5］、類風濕性關節(jié)炎［6］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［7］及炎癥性腸病等［8］方面。研究發(fā)現(xiàn)，IL-33在胃癌組織中表達明顯高于癌旁組織，且血清中IL-33表達水平高的患者生存期較短［9］。考慮到術后的化療已成為臨床治療的常規(guī)方案，提示高表達水平的IL-33是否對化療藥物的敏感性產(chǎn)生影響。為此，本研究旨在探討IL-33與胃癌細胞MGC-803化療敏感性關系及其內(nèi)在機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料人類低分化胃癌細胞株MGC-803由寧波大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室惠贈，細胞培養(yǎng)基RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Hyclone公司，順鉑購于Sigma公司，caspase-3、Cleaved Caspas-3、PARP、Cleaved PARP抗體均購于美國Cell Signaling公司，-actin一抗（鼠抗人）抗體購于北京四正柏，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海碧云天，GoTaq qPCR Master Mix購于美國Promega，試驗所用PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，腺病毒載體Ad-IL-33-EGFP、Ad-EGFP由上海鳴鴻生物公司構建。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染用含10%胎牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人胃癌細胞MGC-803，細胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃、二氧化碳5%。取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中4×104個/孔，用不含抗生素的RPMI1 640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24h后待細胞融合度達80%時根據(jù)腺病毒轉染說明書操作，分別用Ad-IL-33-E GFP、Ad-EGFP腺病毒感染胃癌細胞MGC-803后得到MGC-803-IL-33組，MGC-803-Mock組，未處理的為空白對照組。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖選擇對數(shù)生長期的胃癌細胞，以5×103個/孔的密度接種至96孔板，每組設6個復孔，按照實驗要求進行處理細胞，待處理結束后，加入MTT溶液20 l/孔后繼續(xù)培養(yǎng)，4h后去上清，加150 l/孔的DMSO后，將培養(yǎng)板置于水平搖床上振蕩10 min。酶標儀測定各孔490 nm波長處的吸光度，取6個復孔的平均數(shù)，計算細胞存活率。實驗重復3次。

1.2.3 感染復數(shù)（MOI）的測定將MGC-803消化后制成懸液，按照每孔5 000個細胞接種到滅菌96孔板中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取其中6孔用于計數(shù)。根據(jù)每孔的細胞數(shù)量分別按病毒顆粒與細胞數(shù)的比例50∶1、100∶1和150∶1加入無血清細胞培養(yǎng)基稀釋的病毒溶液。每組濃度設6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h后熒光顯微鏡觀察熒光細胞比例，確定最佳MOI為100∶1。

1.2.4 qRT-PCR測定IL-33、ERCC1、BRCA1的mRNA表達以Trizol一步法提取各組細胞總RNA，按照Promega公司RNA逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，獲取cDNA，行PCR擴增。PCR各引物序列見表1，PCR反應條件見表2，循環(huán)次數(shù)40個周期。以目的基因與內(nèi)參GAPDH的Ct值計算Ct值。

1.2.5 Western blot法檢測凋亡相關蛋白caspase-3、PARP的表達提取各組細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩５鞍鬃冃院竺靠咨蠘?0g，經(jīng)PAGE電泳后轉膜。封閉1 h后，4℃孵育一抗過夜，常溫下孵育相應熒光二抗1h，最后予Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.3 統(tǒng)計方法采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有的實驗數(shù)據(jù)均表述為均數(shù)±標準差，兩組間的比較采用兩獨立樣本檢驗；3組及3組以上比較采用單因素方差分析；多重比較采用SNK-檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 化療藥物CDDP IC50測定將MGC-803細胞接種到96孔板中，24h后分別加入不同濃度的CDDP（0～8g/ml），48 h后進行MTT實驗。MGC-803的細胞活性值分別為1.57±0.03、1.1±0.04、0.83±0.04、0.43±0.08、0.22±0.03，差異無統(tǒng)計學意義（=649.6，＜0.05）。以不加順鉑處理的細胞為空白對照組。空白對照組細胞活力100%，其他處理濃度與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均＜0.05）。見封三彩圖1。根據(jù)實驗結果，在4 g/ml濃度時，細胞活力接近空白對照組的50%，選擇4 g/ml作為后續(xù)實驗濃度。

2.2 MGC-803胃癌細胞轉染IL-33基因對順鉑化療敏感性的影響予Ad-EGFP、Ad-IL-33-EGFP分別感染MGC-803細胞得到細胞記為MGC-803-Mock、MGC-803-IL33。

2.2.1 qRT-PCR檢測感染病毒后細胞IL-33的表達Ad-IL-33-EGFP、Ad-EGFP分別感染MGC-803細胞，24 h后提取總RNA，qRT-PCR測定細胞內(nèi)IL-33 mRNA的表達，結果顯示，MGC-803-IL33細胞內(nèi)IL-33mRNA水平較MGC-803-Mock細胞顯著提高（=50.85，＜0.01）。見封三彩圖2。實驗證實了Ad-IL-33-EGFP可以將目的基因IL-33轉到細胞內(nèi)，使得細胞高表達目的基因。

2.2.2 MTT測定細胞增殖將3組細胞MGC-803、MGC-803-Mock、MGC-803-IL-33接種到96孔板中，外周孔加入PBS，中間60孔加入3組細胞，每組20個復孔。48 h后加入CDDP 4g/ml。應用MTT法測定各組細胞增殖水平?？v坐標為細胞490 nm OD值。結果顯示MGC-803-IL-33細胞增殖能力為1.97± 0.22，較MGC-803、MGC-803-Mock細胞強（1.76±0.11、1.64±0.21，=22.3，＜0.05）。見封三彩圖3。

2.2.3 Westernblot測定細胞內(nèi)capase-3及PARP蛋白的活性取4個6 cm培養(yǎng)皿，接種相等量的MGC-803細胞，待細胞生長到約90%時，取其中一個培養(yǎng)皿進行細胞計數(shù)。另兩個予Ad-EGFP及Ad-IL-33-EFGP，按照MOI 100感染細胞，感染后得到MGC-803-Mock、MGC-803-IL-33，另一個未處理的細胞作為空白對照。然后分別加入CDDP 4 g/ml培養(yǎng)，48 h后提取細胞總蛋白，予Western blot測定capase-3及PARP的活化程度。結果提示：MGC-803-IL-33細胞的caspase-3（1.02±0.21）、PARP（1.75±0.15）活性較蛋白對照組MGC-803（2.44±0.09、5.25±0.29）、MGC-803-Mock［、（1.99±0.12、5.83±0.81）低（=68.54、 56.79，均＜0.05）。見封三彩圖4、5。

2.2.4 qRT-PCR測定細胞內(nèi)ERCC1及BRCA1基因mRNA的表達將細胞MGC-803預先接種到6 cm培養(yǎng)皿中，待細胞生長到約90%時給予Ad-EGFP及Ad-IL-33-EFGP感染細胞，未處理作為空白對照。24 h后加入CDDP 4 g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h提取細胞總RNA。應用qRT-PCR測定3組細胞內(nèi)ERCC1、BRCA1基因的表達。結果顯示ERCC1 mRNA水平分別為8.61±0.52、7.83±0.55、6.22±0.39，BRCA1 mRNA水平分別為7.06±0.51、7.77±0.31、7.67±0.39。提示MGC-803-IL-33細胞內(nèi)ERCC1基因mRNA表達明顯高于對照組（=24.46，＜0.05），而BRCA1基因mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（=3.49，＞0.05）。見封三彩圖6。

3 討論

表1 實時定量PCR引物

表2 qRT-PCR反應條件

胃癌是常見消化道惡性腫瘤之一，加之我國早期胃癌診斷率較低［11］，因此大部分手術治療患者都是中晚期胃癌患者，其手術治療效果有限。對于這部分患者來說化療效果直接影響其預后，而腫瘤細胞對化療藥物的敏感性又是化療療效的決定性因素。隨之而來的另一臨床挑戰(zhàn)則是腫瘤對化療藥物的耐藥現(xiàn)象。順鉑在臨床的應用已經(jīng)超過30年，但仍然是應用最廣泛的藥物之一［12］。而在胃癌的化療中以第3代鉑類藥物奧沙利鉑為主。因此筆者選擇順鉑進行胃癌細胞化療藥物敏感性的實驗是合理可行的。

IL-33作為一個核因子的作用知之甚少。研究認為在細胞未受到炎癥刺激時IL-33主要存在于細胞核內(nèi)［13］，此時IL-33在細胞內(nèi)可能是作為一個核因子形式而存在。研究顯示在順鉑耐藥的膠質瘤細胞株IL-7表達明顯升高［14］，應用RNA干擾技術下調IL-7的表達后細胞對順鉑敏感性提高。本研究以腺病毒為載體，將IL-33轉染到胃癌細胞MGC-803后發(fā)現(xiàn)，轉染后的細胞對順鉑藥物的敏感性明顯下降，呈現(xiàn)出對順鉑的耐藥。Western blot方法測定相關的凋亡蛋白表達結果也提示高表達IL-33后，細胞caspase-3及PARP的表達水平較對照組明顯降低，細胞出現(xiàn)明顯的抗凋亡現(xiàn)象。進一步檢測發(fā)現(xiàn)轉染IL-33基因后的細胞ERCC1基因mRNA表達水平升高，而ERCC1是DNA損傷后核苷酸切除修復系統(tǒng)中的重要一員。國內(nèi)外眾多研究證實了ERCC1基因表達與順鉑耐藥有關［15］。因此根據(jù)本研究結果推測，IL-33可能作為一種核因子調控了基因ERCC1的表達，使得細胞對順鉑誘導的DNA損傷修復能力增強，從而呈現(xiàn)出對順鉑的敏感性降低。本研究結果胃癌細胞高表達IL-33后對順鉑的藥物敏感性降低，其機制可能是通過上調ERCC1基因表達，為腫瘤順鉑耐藥的機制研究提供了新的思路，同時也為腫瘤患者選擇合適有效的化療方案的提供了新的理論依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.03.023

R735.2

A

1671-0800（2016）03-0323-03

2015-09-11

（本文編輯：姜曉慶）

寧波市自然科學基金（2013A610218）

315010寧波，寧波市第一醫(yī)院

丁小云，Email：dyyyding@ 126.com