施益九，楊斌，俞秀沖，張志平，嚴(yán)志龍

TM4SF5在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

施益九，楊斌，俞秀沖，張志平，嚴(yán)志龍

目的探討胃癌組織中四跨膜蛋白5（TM4SF5）的表達(dá)情況及意義。方法采用Westernblot及SP免疫組化方法，檢測(cè)胃癌組織中TM4SF5、E-鈣黏蛋白（E-cardherin）及波形蛋白（vimentin）表達(dá)情況。結(jié)果westernblot結(jié)果顯示TM4SF5蛋白的表達(dá)與組織細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜侵犯及TNM分期均有關(guān)（均＜0.05），TM4SF5蛋白表達(dá)的病理特征相關(guān)因素分析發(fā)現(xiàn)TM4SF5蛋白的表達(dá)與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期均無關(guān)（均＞0.05），但與腫瘤的分化程度、腫瘤的浸潤深度均有關(guān)（均＜0.05）。結(jié)論TM4SF5蛋白在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，并可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞間質(zhì)化促進(jìn)侵襲及轉(zhuǎn)移，TM4SF5蛋白可能作為分子干預(yù)靶點(diǎn)抑制腫瘤進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移。

胃腫瘤；癌；間質(zhì)化；四跨膜蛋白5；E-鈣黏蛋白；vimentin

胃癌是常見的惡性腫瘤，全世界因癌癥死亡的患者中，死于胃癌的人數(shù)居第2位［1］。目前胃癌的診治水平有了一些提高，但由于胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制仍未完全闡明，造成胃癌的診治無重大突破，胃癌的轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因。目前研究認(rèn)為上皮間質(zhì)化（EMT）在胃癌進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。近來發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞株SNU449中四跨膜蛋白5（TM4SF5）的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致上皮細(xì)胞間質(zhì)化的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞狹長、細(xì)胞間連接喪失、過度增殖、異常的肌動(dòng)蛋白捆綁，并且獲得間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記：E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)伴有波形蛋白（vimentin）表達(dá)上調(diào)［2］，但國內(nèi)尚無報(bào)道TM4SF5在胃癌中表達(dá)及其意義。本文旨在研究TM4SF5在胃癌組織中表達(dá)，并探討其在誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化中的作用具有重要意義。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集收集2012年1月至2014年12月在寧波市第一醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除并被病理證實(shí)為胃癌的癌組織及癌旁組織共86份（86例患者），其中男46例，女40例；年齡36～82歲，中位年齡54歲；均行D2或D2+胃癌根治術(shù)，均達(dá)到R0或R1切除，術(shù)前均未行放療和/或化療。

1.2 試劑及器材SP法免疫組化染色超敏試劑盒（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兔抗人TM4SF5單克隆抗體和兔抗人E-cadherin單克隆抗體（美國CST公司）。鼠抗人Vimentin單克隆抗體（美國Thermo Scentific公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗及抗鼠二抗（美國Jackson公司）；Shandon325型石蠟切片機(jī)，光學(xué)顯微鏡（X41型），TC-120s型智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)。蛋白電泳轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-RAD公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法Western blot檢測(cè)：細(xì)胞標(biāo)本及經(jīng)消化后的新鮮組織樣本行Westernblot檢測(cè)，重復(fù)3次取平均值。目的蛋白表達(dá)水平以目的蛋白條帶密度灰度值和條帶面積的乘積與-actin蛋白條帶密度灰度值和條帶面積的乘積的比值表示。

免疫組化：將標(biāo)本用石蠟包埋后切成4 m的切片，其中一張切片進(jìn)行常規(guī)HE染色作組織學(xué)診斷，另外的切片保存作免疫組化法染色檢測(cè)，E-cadherin、TM4SF5單克隆抗體被用作第一抗體，緩沖鹽液做陰性對(duì)照.

1.4 統(tǒng)計(jì)方法所有結(jié)果均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Westernblot檢測(cè)胃癌標(biāo)本中EMT相關(guān)因子E-cardherin、Vimentin及TM4SF5蛋白表達(dá)情況E-cardherin的表達(dá)在癌組織、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜侵犯、Ⅲ-Ⅳ期患者中要低于癌旁組織、高分化、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移、未侵及漿膜層、Ⅰ～Ⅱ期患者。vimentin、TM4SF5蛋白的表達(dá)在癌組織、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜侵犯、Ⅲ～Ⅳ期患者中要高于癌旁組織、高分化、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移、未侵及漿膜層、Ⅰ～Ⅱ期患者。見封二彩圖9。

2.2 TM4SF5蛋白表達(dá)與臨床病理相關(guān)因素分析TM4SF5蛋白的表達(dá)與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期無關(guān)（均＞0.05），但與腫瘤的分化程度、腫瘤的浸潤深度均有關(guān)（均＜0.05）。見表1。

3 討論

近年來，EMT被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)重要機(jī)制，被越來越多的研究所證實(shí)［3-4］。正常上皮細(xì)胞的排列具有明顯的極性，相互之間通過各種連接結(jié)構(gòu)而緊密聯(lián)系，并表達(dá)多種上皮細(xì)胞表面標(biāo)記，如E-cadherin及ZO家族蛋白等。當(dāng)這些細(xì)胞間聯(lián)系結(jié)構(gòu)被破壞后，細(xì)胞骨架的重構(gòu)使上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)上的改變。首先是互相之間的聯(lián)系減弱進(jìn)而松散，其次是細(xì)胞喪失極性排列，進(jìn)而喪失原來的上皮標(biāo)記而獲得間質(zhì)表型，最終的結(jié)果是這類細(xì)胞獲得了更強(qiáng)的向外遷移能力。上述這個(gè)過程即EMT［5-7］。EMT的主要分子特征：E-cadherin等上皮標(biāo)志物表達(dá)和功能缺失，同時(shí)vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物過量表達(dá)［8］。最早發(fā)現(xiàn)EMT這一現(xiàn)象是在胚胎發(fā)育過程中，而最新的一些研究則認(rèn)為，腫瘤進(jìn)展可能與EMT這一現(xiàn)象密切關(guān)聯(lián)，理由是EMT增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移能力，而這恰恰是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移所必不可少的［9-10］。

近來的研究發(fā)現(xiàn)，TM4SF5在肝癌細(xì)胞株SNU449中的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致上皮細(xì)胞間質(zhì)化的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞狹長、細(xì)胞間連接喪失、過度增殖、異常的肌動(dòng)蛋白捆綁，并且獲得間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記：E-cadherin表達(dá)下調(diào)［11-12］。本研究應(yīng)用免疫組化及Westernblot方法發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中TM4SF5蛋白呈陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率與腫瘤的分化程度、腫瘤的浸潤深度有關(guān)，Westernblot研究發(fā)現(xiàn)，TM4SF5蛋白的表達(dá)伴有E-cadherin的表達(dá)下調(diào)及vimentin的表達(dá)上調(diào)，提示TM4SF5蛋白的陽性表達(dá)可能與腫瘤EMT進(jìn)程相關(guān)。

綜上所述，胃癌的發(fā)生發(fā)展及其生物學(xué)特征受到多種因素的影響，TM4SF5可能通過介導(dǎo)腫瘤間質(zhì)化參與腫瘤細(xì)胞分化、侵襲及轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步研究TM4SF5在胃癌組織中表達(dá)及作用，以期作為分子干預(yù)靶點(diǎn)可能具有重要意義。

表1 TM4SF5蛋白表達(dá)相關(guān)因素分析

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.03.020

R735.2

A

1671-0800（2016）03-0317-03

2016-01-06

（本文編輯：姜曉慶）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計(jì)劃A類（2016KYA163）

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