陳昌暉，肖維華

陳昌暉，肖維華

目的探討NF-BP65與BCL-2蛋白在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)意義及與預(yù)后的關(guān)系。方法采用免疫組化SP法檢測(cè)30例涎腺腺樣囊性癌組織中NF-BP65與BCL-2蛋白表達(dá)水平，以多形性腺瘤、癌旁正常涎腺組織作為對(duì)照。結(jié)果涎腺腺樣囊性癌、多形性腺瘤和正常涎腺組織中NF-BP65表達(dá)的陽(yáng)性率分別為83.3%、33.3%和10.0%，BCL-2表達(dá)的陽(yáng)性率分別為63.3%、26.7%和10.0%，兩者表達(dá)在腫瘤組與對(duì)照組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）；NF-BP65與BCL-2表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（=0.712，＜0.05）；NF-BP65、BCL-2表達(dá)對(duì)腺樣囊性癌患者的5年生存率均無(wú)明顯影響。結(jié)論NF-BP65和BCL-2在涎腺腺樣囊性癌中均有較高水平表達(dá)，在與多形性腺瘤比較中亦有一定鑒別診斷價(jià)值，兩者表達(dá)與腺樣囊性癌5年生存率無(wú)關(guān)。

腺樣囊性癌；NF-BP65；BCL-2；免疫組化

涎腺腺樣囊性癌（ACC）是一種較常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤，侵襲性強(qiáng)，早期即侵犯神經(jīng)，易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。NF-BP65是最先在成熟的B細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄蛋白［1-2］。BCL-2是迄今研究的最深入和廣泛的凋亡調(diào)控基因蛋白之一［3］。鑒于此，本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)NF-BP65和BCL-2在ACC、多形性腺瘤（PA）及正常涎腺組織（NSGT）的表達(dá)水平，以分析NF-BP65和BCL-2在ACC中的表達(dá)情況及意義，同時(shí)探討兩者的相關(guān)性、可能的機(jī)制及對(duì)預(yù)后的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2006年1月至

2009年12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔頜面外科收治的涎腺ACC手術(shù)患者30例，以切除的ACC組織為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)收集PA組織30例為腫瘤對(duì)照組，NSGT組織30例為正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組男11例，女28例；年齡14～85歲；發(fā)生于腮腺有7例，頜下腺5例，腭部9例，上頜竇4例，舌4例，鼻腔1例；ACC直徑＜1cm者15例，＞3cm者6例，介于兩者間9例。隨訪時(shí)間以術(shù)后第2天開(kāi)始計(jì)算，對(duì)患者5年生存情況進(jìn)行隨訪，截止日期2014年12月31日。30例ACC除一例失訪外，其余29例患者生存時(shí)間范圍為8～96個(gè)月。所有患者術(shù)前未進(jìn)行放化療治療。所有標(biāo)本經(jīng)病理檢查確診后經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑小鼠抗人NF-BP65單克隆抗體試劑盒和小鼠抗人BCL-2單克隆抗體試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色（EliVisionTM plus二步法）標(biāo)本制成4 m石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化和PBS（pH=7.4）沖洗后，切片放入高壓鍋中進(jìn)行高溫抗原修復(fù)，冷卻后用PBS液沖洗，室溫下孵育10 min，加1滴一抗，置于4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。第2天PBS沖洗結(jié)束后，加1滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫孵育20min。加1滴酶標(biāo)抗兔聚合物，室溫孵育30 min。重復(fù)PBS沖洗步驟一次，加1滴新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間。水洗、蘇木素復(fù)染、0.1%HCL分化和PBS返藍(lán)。切片經(jīng)酒精脫水干燥、二甲苯透明和樹(shù)膠封片，最后在顯微鏡下觀察組織。

1.3 免疫組化陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)NFBP65以胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性；BCL-2以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。以陽(yáng)性細(xì)胞所占比率＜10%判定為陰性（-），10%～25%為弱陽(yáng)性（+），26%～50%為中陽(yáng)性（2+），＞51%為強(qiáng)陽(yáng)性（3+）。弱陽(yáng)性、中陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性均記為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用檢驗(yàn)；NF-BP65與BCL-2表達(dá)相關(guān)性分析采用相關(guān)分析；對(duì)ACC預(yù)后的影響采用單因素生存分析及檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-BP65在涎腺ACC、PA和NSGT中的表達(dá)NF-BP65在涎腺ACC、PA和NSGT的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=27.07，＜0.05）；AAC與PA的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；AAC與NSGT的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；PA與NSGT的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.06）。見(jiàn)表1、圖1～2。

2.2 BCL-2在涎腺ACC、PA和NSGT中的表達(dá)BCL-2在涎腺ACC、PA和NSGT中的表達(dá)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=12.51，＜0.05）；AAC與PA表達(dá)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；；AAC與NSGT表達(dá)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；PA與NSGT表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.28）。見(jiàn)表2、圖3～4。

2.3 NF-BP65與BCL-2表達(dá)在涎腺ACC中的相關(guān)性分析30例涎腺ACC中NF-BP65陽(yáng)性表達(dá)病例中有19例BCL-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性；Pearson相關(guān)分析顯示，NF-BP65與BCL-2表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（=0.71，＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 隨訪資料統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組ACC病例除一例失訪外，均進(jìn)行定期隨訪，隨訪率為93.5%（29/30），5年累積生存率62.07%（18/29），術(shù)后無(wú)瘤生存率37.93%（11/29），帶瘤生存率13.79%（4/29），復(fù)發(fā)生存比10.34%（2/29），轉(zhuǎn)移生存比3.45%（1/29）。死亡11例，5年累積病死率為37.93%，中途失訪病例不計(jì)入預(yù)后因素統(tǒng)計(jì)范圍。

2.5 單因素生存分析

2.5.1 NF-BP65表達(dá)與涎腺ACC預(yù)后的關(guān)系對(duì)2例隨訪病例進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示：隨訪期內(nèi)NF-BP65表達(dá)陰性患者平均生存期為（67.0±7.6）個(gè)月，中位生存期為（59.0±7.5）個(gè)月；95%分別為（52.0～82.0）和（44.3～73.70）個(gè)月。NF-BP65表達(dá)陽(yáng)性患者平均生存期為（50.3±5.0）個(gè)月，中位生存期為（56.0±7.5）個(gè)月；95%分別為（40.5～60.2）和（41.3～70.7）個(gè)月。單純NF-BP65表達(dá)陽(yáng)性與陰性5年生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.45）。見(jiàn)圖5。

2.5.2 BCL-2表達(dá)與涎腺ACC預(yù)后的關(guān)系BCL-2表達(dá)陰性患者平均生存期為（63.4±6.7）個(gè)月，中位生存期為（64.0±7.1）個(gè)月；95%分別為（50.2～76.6）和（50.0～77.9）個(gè)月。BCL-2表達(dá)陽(yáng)性患者平均生存期為（46.9±5.6）個(gè)月，中位生存期為（56.0±11.6）個(gè)月；95%分別為（35.9～58.0）和（33.2～78.7）個(gè)月。單純BCL-2表達(dá)陽(yáng)性與陰性5年生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.09）。見(jiàn)圖6。

3 討論

NF-BP65是一種功能復(fù)雜的核轉(zhuǎn)錄因子，參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)，與多種趨化、生長(zhǎng)和黏附相關(guān)的因子有關(guān)。同時(shí)NF-BP65還參與機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)，并在腫瘤細(xì)胞凋亡等方面起作用［4］。涎腺ACC可很好地展示涎腺腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其不同分化類型表明其初始為一種惰性腫瘤，隨著NF-BP65等關(guān)鍵信號(hào)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路的激活，其累積的能導(dǎo)致新突變的“土壤”足夠富于，ACC的產(chǎn)生、發(fā)展級(jí)別和危險(xiǎn)度可能逐漸增加［5］。本研究觀察到NF-BP65在涎腺ACC、PA和NSGT中的表達(dá)是存在差異的，提示NF-BP65與ACC是有關(guān)的，但與PA相比，發(fā)現(xiàn)NF-BP65的表達(dá)還是明顯高于PA。提示NF-BP65在兩種病變中的表達(dá)強(qiáng)度和數(shù)量存在差異，這與病變所處階段和嚴(yán)重程度一致。

研究證實(shí)許多腫瘤中凋亡相關(guān)基因表達(dá)異常，主要是抑凋亡基因表達(dá)上調(diào)，促凋亡基因表達(dá)下調(diào)［6］。抗凋亡基因BCl-2作為最重要的腫瘤細(xì)胞原癌基因之一，能阻斷細(xì)胞程序化死亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，導(dǎo)致異常細(xì)胞的積聚，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而且與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)［7］。在某些未知的新信號(hào)通路的反復(fù)介入下，部分出現(xiàn)了特定的基因突變，如野生性P53和BCL-2基因變化。腫瘤逐步進(jìn)展，發(fā)生惡變，這個(gè)過(guò)程長(zhǎng)短不一，也可以一開(kāi)始就出現(xiàn)ACC或其他惡性上皮性腫瘤。

圖1 NF-BP65在涎腺ACC中以胞漿表達(dá)為主，部分可見(jiàn)核漿共表達(dá)（Elivision法，×200）

圖2 NF-BP65在涎腺PA中表達(dá)定位于腺上皮胞漿，沿腺腔規(guī)則分布（Elivision法，×200）

圖3 BCL-2在涎腺ACC中的表達(dá)明顯增多，彌漫性分布（Elivision法，×200）

圖4 BCL-2在涎腺PA中的表達(dá)呈散在局灶表達(dá)（Elivision法，×200）

表1 不同組別NF-BP65的陽(yáng)性表達(dá)情況

表2 不同組別BCL-2的陽(yáng)性表達(dá)情況

表3 NF-BP65與BCL-2表達(dá)的相關(guān)性

圖5 NF-BP65表達(dá)與5年生存率

圖6 BCL-2表達(dá)與5年生存率

NF-BP65和BCL-2蛋白介入的兩種干預(yù)機(jī)制是否存在相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未給出明確答案，這也是本研究設(shè)立的初始動(dòng)機(jī)。本文結(jié)果顯示NF-BP65與BCL-2表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（=0.71，＜0.05），表明兩者與涎腺ACC中存在協(xié)同作用。NF-BP65可以通過(guò)對(duì)凋亡蛋白和抗凋亡蛋白不平衡表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，實(shí)現(xiàn)抗凋亡功能。NF-BP65所介導(dǎo)的對(duì)自我吞噬作用的抑制效應(yīng)，是其發(fā)揮抗凋亡作用的新機(jī)制［8］。

NF-BP65和BCL-2是否可以作為惡性腫瘤判斷預(yù)后的指標(biāo)仍充滿爭(zhēng)議。尤金強(qiáng)等［9］則認(rèn)為BCL-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)，臨床預(yù)后可能越佳，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不一致的。而尹萬(wàn)忠等［10］研究表明BCL-2蛋白表達(dá)僅與ACC的臨床分期正相關(guān)，但與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)，與本研究結(jié)果較為吻合。但通過(guò)生存曲線的觀察，筆者還是發(fā)現(xiàn)BCL-2陽(yáng)性表達(dá)可能偏向具有較好的5年生存率，但數(shù)據(jù)否認(rèn)了這種直觀印象，即使單因素P值為0.09已經(jīng)接近差異性統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。NF-BP65和BCL-2蛋白在改善ACC患者的預(yù)后可能有一定協(xié)同作用。由此導(dǎo)致的細(xì)胞周期延長(zhǎng)可能會(huì)延緩細(xì)胞增殖，在生存曲線上則表現(xiàn)為非統(tǒng)計(jì)差異性曲線左移。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)NFBP65和BCL-2在涎腺ACC中有較高水平的表達(dá)，提示兩者與涎腺ACC發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。此外，兩者可為鑒別涎腺ACC和涎腺實(shí)體型或篩狀結(jié)構(gòu)的PA提供一定的參考依據(jù)。遺憾的是，NFBP65和BCL-2蛋白表達(dá)與涎腺ACC的預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性，間接驗(yàn)證了單因素調(diào)節(jié)對(duì)預(yù)后影響的局限性。

［1］Hagemann T，Wilson J，Kulbe H，et al. Macrophages induce invasiveness of epitheial cancer cell via NF-KB and JNK［J］. Immunol，2005，175（2）:1197-1205.

［2］Bernal MB，LovelyL.Therole of NF-KB andNF-KB-2mediated rapopptosis in lymphomas［J］.Proc Natl Acad Scl USA，2006 103（24）:9220-9222.

［3］王海英，陳恩樂(lè)，周琴，等.新輔助治療對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（1）: 171-174.

［4］張強(qiáng)，李金源，王曉波.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和核轉(zhuǎn)錄因子p65在多形性腺瘤中的表達(dá)及其意義［J］.中國(guó)綜合臨床，2011，27（8）:833-835.

［5］邱靜，戴小麗，張桂春，等.NF-KB、VEGF對(duì)涎腺腺樣囊性癌血管生成的影響及意義［J］.醫(yī)學(xué)臨床研究，2014，31（9）:1810-1813.

［6］Cory S，Huanng DC，Adams JM.The Bcl-2 family：roles in cell survivaland oncogenesis［J］.Oncogene，2003，22（53）: 8590-8607.

［7］徐金標(biāo)，魏軍水，孫鑫.腮腺腫瘤中Bcl-2生物活性改變對(duì)手術(shù)指導(dǎo)意義的評(píng)價(jià)［J］.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2013，25（2）:173-174.

［8］Gobe G，Rubin M，Williams G，et a1.Apoptosis and expression of Bcl-2，Bcl-x，and Bax inrenal cell carcinomas［J］.Cancer Invest，2002，20（3）:324-332.

［9］尤金強(qiáng)，王平.p53、Bcl-2和bax基因蛋白表達(dá)與眼眶淚腺腺樣囊性癌的關(guān)系［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88（28）:1978-1982.

［10］尹萬(wàn)忠，王寶明，宋文植，等.Hsp70、Bcl-2在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2006，10（6）:580-582.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.03.059

R734.2

A

1671-0800（2016）03-0393-03

2015-05-18

（本文編輯：陳志翔）

浙江省衛(wèi)生廳一般項(xiàng)目（2012KYB188）

315800寧波，寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院

陳昌暉，Email：ccchzr91@ 163.com