張立華，孫鳳杰，趙文亞，鄭丹丹，王京龍

（棗莊學院生命科學學院，山東 棗莊 277160）

石榴皮木醋液的化學成分及抗氧化活性

張立華，孫鳳杰，趙文亞，鄭丹丹，王京龍

（棗莊學院生命科學學院，山東 棗莊 277160）

為探索石榴皮資源利用的新途徑，以石榴皮為原料經(jīng)干餾（350～500 ℃）制備了木醋液，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析其化學成分，通過對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基清除實驗評價其抗氧化活性。結(jié)果顯示，石榴皮木醋液的總酚、總酮和有機酸含量分別為10.92、7.81 mg/mL和2.53%；共檢測出27 種有機化合物，包括酚類、有機酸、醇類、烷烴、醛類及酮類化合物等。石榴皮木醋液對DPPH自由基和羥自由基清除力的VC當量分別為10.22 μg/mg和45.19 μg/mg。結(jié)果表明，石榴皮木醋液可作為一種天然抗氧化劑資源，具有一定的開發(fā)利用價值。

石榴皮；木醋液；化學成分；抗氧化活性

張立華， 孫鳳杰， 趙文亞， 等. 石榴皮木醋液的化學成分及抗氧化活性［J］. 食品科學， 2016， 37（8）: 127-130. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201608022. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lihua， SUN Fengjie， ZHAO Wenya， et al. Chemical constituents and antioxidant activities of wood vinegar from pomegranate husk［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 127-130. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608022. http://www.spkx.net.cn

木醋液，也叫植物酸，泛指農(nóng)林加工剩余物、廢棄物等生物質(zhì)干餾過程中的氣體混合物經(jīng)冷凝分離后得到的液體產(chǎn)物［1］。木醋液中主要成分是水，含量為80%～90%，其次是有機酸、酚類、醇類和酮類等物質(zhì)［2-3］。木醋液有很多用途，可以作為除臭劑、消毒劑、食品添加劑、植物生長促進劑、土壤改良劑、醫(yī)藥和農(nóng)藥等的原料［4-6］。在美國、日本、韓國等國家的農(nóng)業(yè)中均獲得推廣應(yīng)用，在美國木醋液主要用在花園園藝，在日本每年大約生產(chǎn)4 000萬 L的木醋液，其中一半應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［7-9］。而在我國木醋液的研究起步較晚，應(yīng)用還不夠廣泛。

石榴皮是石榴（Punica granatum L.）的果皮，占石榴果實的20%～30%，富含多酚、類黃酮等活性物質(zhì)［10］，具有顯著的抑菌、抗癌、抗病毒、抗氧化等作用［11-12］。但目前石榴皮還沒被充分利用，大都被廢棄，不僅污染環(huán)境，還造成資源浪費。對石榴皮資源利用的研究多涉及以石榴皮為原料提取單寧、安石榴苷、鞣花酸及黃酮等［13-14］。有關(guān)石榴皮木醋液方面鮮見報道。本實驗分析了石榴皮木醋液的化學成分及抗氧化活性，以期為石榴皮資源的開發(fā)利用開辟新的途徑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

石榴皮，即成熟石榴的果皮，產(chǎn)地為山東省棗莊嶧城石榴園向陽山坡薄地，品種為大青皮石榴，樹齡為20 a。使用鼓風干燥箱在80 ℃條件下烘干。

鄰二苯酚、甲基環(huán)戊烯醇酮標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美國Sigma公司；Folin-酚試劑、抗壞血酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、氫氧化鉀、無水乙醚、無水硫酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-2000型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；干餾釜 南京林業(yè)大學林產(chǎn)化工學院；7000B氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3方法

1.3.1石榴皮木醋液的制取

［15］中的方法，將烘干石榴皮粉碎成約0.3 cm粒徑的顆粒，然后將石榴皮顆粒放入干餾釜中，以1 kW的功率持續(xù)加熱，溫度控制在350～500 ℃范圍，在冷凝裝置中通入冷水，冷凝干餾時產(chǎn)生的氣體，收集餾出液，靜置30 d，木醋液分離為3 層，上層為少量油狀物，中層為澄清液，底層為黏稠的木焦油等雜質(zhì)。用虹吸法取中層的澄清液，并與5%的活性炭粉末混合，攪拌10 min，靜置3 d，過濾得精制石榴皮木醋液。

1.3.2總酚含量測定

取精制的石榴皮木醋液用蒸餾水稀釋200 倍，然后采用Folin酚法［16］測定其總酚含量，以鄰苯二酚為標準品。

1.3.3總酮含量測定

取精制的石榴皮木醋液用蒸餾水稀釋20 倍，然后采用Al（NO3）3-NaNO2比色法［17］測定總酮含量，以甲基環(huán)戊烯醇酮為標準品。

1.3.4有機酸含量測定

采用酸堿電位滴定法［3］，有機酸總量以醋酸質(zhì)量分數(shù)計。

1.3.5石榴皮木醋液的有機成分分析

1.3.5.1石榴皮木醋液的預(yù)處理

參照文獻［18］中的方法預(yù)處理石榴皮木醋液，取精制木醋液30 mL，每次用10 mL乙醚，萃取6 次，合并乙醚萃取液，加入2.0 g無水硫酸鈉吸收其中的水分，過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醚，萃取液濃縮至3 mL，用作GC-MS待測量品。

1.3.5.2GC-MS測定

參照文獻［18］中直接進量法對石榴皮木醋液萃取濃縮液成分用GC-MS法進行分析。

1.3.5.3GC條件

DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進量口溫度220 ℃；升溫程序：柱溫60 ℃，恒溫2 min后，以6.0 ℃/min速率升溫至240 ℃，恒溫8 min；分流進量80∶1；載氣流速1.0 mL/min。

1.3.5.4MS條件

電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍35～400 u，質(zhì)譜標準庫NIST 11。

1.3.6羥自由基（·OH）清除率的測定

參照文獻［19］方法，反應(yīng)體系體積為5 mL，其中含0.15 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4），114 μmol/L番紅花，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）-Fe2+（1 mmol/L硫酸亞鐵含2 mmol/L EDTA-Na2），3% H2O2（新鮮配制）以及不同質(zhì)量濃度的量品；以蒸餾水代替量品作為量品空白，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，以0.3 mol/L EDTA-Na2終止反應(yīng)，于波長520 nm處測定光吸光度，以去離子水代替量品和FeSO4的用量為對照。按公式（1）計算·OH清除率。

式中：A量品空白為不含量品的空白吸光度；A量品為量品吸光度；A對照為不含量品和FeSO4的對照的吸光度。

繪制量品不同用量條件下清除率曲線，求出清除率為50%時的濃度，即半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

以質(zhì)量濃度20 μg/mL的VC為參照，按上述步驟操作并求出IC50，通過比較二者的IC50值計算出量品的VC當量（μg/mg）。

1.3.7DPPH自由基清除率的測定

參照文獻［20］的方法并加以改進，操作方法為：向3 mL吸光度為1.5的DPPH自由基-甲醇溶液中加入一定量的試量（空白對照用等量重蒸水代替），總體積用蒸餾水補充至4 mL用力搖勻后于室溫條件下放置30 min，再用光徑1 cm比色皿測定DPPH自由基混合溶液在波長517 nm處吸光度（A517nm），用2.5 mL甲醇與0.5 mL試量混合液調(diào)儀器零點，以扣除試量本身顏色的影響。按公式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白對照吸光度；A量品為量品的吸光度。

并繪制量品不同用量條件下清除率曲線，求出其IC50。以質(zhì)量濃度20 μg/mL的VC為參照，按上述步驟操作并求出IC50，通過比較二者的IC50值計算出量品的VC當量（μg/mg）。

2　結(jié)果與分析

2.1石榴皮木醋液的制取率及其總酚、總酮及有機酸含量

按照1.3.1節(jié)中的方法多次制取石榴皮木醋液，獲得粗制木醋液的得率平均為24.5%，精制木醋液的得率平均為16.3%，經(jīng)測定精制木醋液中可溶性固形物含量為6.4%，其余93.6%為水分。經(jīng)測定，石榴皮木醋液中總酚含量為10.92 mg/mL，總酮含量為7.81 mg/mL，有機酸占體積分數(shù)的2.53%。有報道［3］工業(yè)品木醋液中有機酸占到5.13%，核桃殼木醋液中有機酸含量最高為6.31%［21］，杜仲葉林枝木醋液中有機酸含量最高達13.38%［22］?？梢姡緦嶒炈剖衿つ敬滓河袡C酸含量相對較低。

2.2有機成分分析

圖1　石榴皮木醋液GC-MS總離子質(zhì)譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of wood vinegar from pomegranate husk

將石榴皮木醋液按1.3.5節(jié)所述方法處理，并按所述條件進行GC-MS分析，所得質(zhì)譜見圖1，根據(jù)NIST數(shù)據(jù)庫檢索和人工解析等方法確定物質(zhì)種類。共鑒定出27 種物質(zhì)，見表1。主要有酚類、有機酸、醇類、烷烴、醛類及酮類化合物等。其中酚類有9 種，苯酚、麥芽酚、2，4-二甲苯酚、2-乙基苯酚、甲氧甲酚、鄰苯二酚、2，6-二叔丁基對甲酚、2，6-二甲氧基苯酚、2，4-二枯基酚。有機酸有乙酸、3-癸烯酸和10-十一碳炔酸3 種。醇類有6 種，分別為3-羥基-苯乙醇、5-異丙烯基-2-甲基-環(huán)氧環(huán)己烷-2-醇、木焦油醇、對二甲氧基苯甲醇、2-甲基十六醇、叔十六硫醇。烷烴類有5 種，分別為3，4，5-三甲氧基甲苯、三十五烷、1，54-二溴五十四烷、二十九烷和二十五烷。醛類有5-甲基-2-呋喃羧酸醛和5-羥甲基糠醛2 種。酮類有4-羥基-3-甲氧基苯丙酮。還有1 種含N雜環(huán)化合物1-乙酰咪唑。

表1　石榴皮木醋液的主要化學成分Table 1 Chemical constituents of wood vinegar from pomegranate husk

2.3對·OH及DPPH自由基的清除能力

表2　石榴皮木醋液對·OH及DPPH自由基的清除結(jié)果Table 2 Scavenging activities of pomegranate husk wood vinegar against hydroxyl and DPPH free radicals

由表2可知，在相同的反應(yīng)體系中VC對·OH及DPPH自由基的IC50分別為0.17 mg/mL和0.39 mg/mL，石榴皮木醋液對2 種自由基的IC50分別為16.67 mg/mL和8.63 mg/mL；對·OH的清除能力石榴皮木醋液相當于VC的量，即VC當量為10.22 μg/mg，對DPPH自由基的清除能力石榴皮木醋液的VC當量為45.19 μg/mg。單從數(shù)據(jù)上看，石榴皮木醋液對2 種自由基的清除能力明顯低于抗氧化劑VC，可石榴皮木醋液中水的比例在90%以上，因此，仍能說明石榴皮木醋液具有較強的體外抗氧化活性。

3　討論與結(jié)論

經(jīng)常規(guī)化學分析的方法測定出石榴皮木醋液中總酚含量為10.92 mg/mL、總酮含量為7.81 mg/mL、有機酸含量占體積分數(shù)的2.53%。與其他類型的木醋液相比，有機酸的含量較低，核桃殼木醋液中有機酸含量最高為6.31%［21］，杜仲葉林枝木醋液中有機酸含量最高達13.38%［22］，這可能與制取木醋液的原料有關(guān)，原料不同有機酸含量差異較大。另外，制作木醋液的溫度對有機酸含量也有顯著影響，溫度越高木醋液中有機酸含量越低［21］，本實驗所選溫度在350～500 ℃范圍內(nèi)，溫度相對較高。

進一步通過GC-MS分析其成分，共檢出27 種化合物，其中最多的是酚類化合物有9 種成分，其次為醇類和烷烴化合物，分別為6 種和5 種，此外，還有3 種有機酸、2 種醛，酮和雜環(huán)化合物各1 種。毛巧芝等［23］在170～370 ℃溫度段苦杏殼木醋液中檢出化合物27 種，王元等［21］在90～190、190～300 ℃及300～480 ℃3 個溫度段的核桃殼木醋液中分別檢出13、42 種和37 種物質(zhì)。對比分析，不同植物材料的木醋液中化合物的類別基本相同，主要是酸類、酚類、醛類、酮類、醇類等，還有少數(shù)呋喃和酯類物質(zhì)。不同植物材料、不同干餾工藝會影響所制木醋液的化學成分，并且差別明顯。

通過測定石榴皮木醋液對·OH及DPPH自由基的清除能力評價其抗氧化活性，實驗結(jié)果表明石榴皮木醋液具有較強的抗氧化活性，這與石榴皮木醋液含有多種酚類物質(zhì)有關(guān)，通常認為酚類物質(zhì)是一類強抗氧化劑。其中，石榴皮木醋液中所含的2，6-二叔丁基對甲酚就是一種被用作抗氧化劑的食品添加劑。因此，石榴皮木醋液可以作為進一步制取抗氧化劑的原料。

綜上所述，石榴皮木醋液所含化學成分比較豐富，具有較強的抗氧化活性，開發(fā)利用，變廢為寶，提高石榴資源生物利用度。

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Chemical Constituents and Antioxidant Activities of Wood Vinegar from Pomegranate Husk

ZHANG Lihua， SUN Fengjie， ZHAO Wenya， ZHENG Dandan， WANG Jinglong
（College of Life Sciences， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160， China）

In order to explore a new approach to the utilization of pomegranate husk， wood vinegar was prepared by pyrolyzing pomegranate husk in the temperature range of 150-400 ℃. Chemical constituents of the wood vinegar were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Its antioxidant activities were evaluated by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical and hydroxyl radical scavenging methods. The results showed that the contents of total phenols， total ketones and organic acid in the wood vinegar were 10.92 mg/mL， 7.81 mg/mL and 2.53% respectively. A total of 27 compounds were detected by GC-MS analysis from the wood vinegar， mainly including phenols， organic acids，alcohols， alkanes， aldehydes and ketones. Its scavenging activities against DPPH and OH hydroxyl radicals were 10.22 μg/mg and 45.19 μg/mg VC equivalent， respectively. This study suggested that wood vinegar from pomegranate husk has the potential to be used as a natural antioxidant resource.

pomegranate husk； wood vinegar； chemical constituents； antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201608022

S482.2

A

1002-6630（2016）08-0127-04

2015-08-18

山東省自然科學基金項目（ZR2013BL018）；山東農(nóng)業(yè)大學作物生物學國家重點實驗室開放基金項目（2014KF09）

張立華（1969—），男，教授，博士，研究方向為植物資源開發(fā)及采后生理。E-mail：chinazhanglh@163.com

引文格式：