騰 飛，鄭 悅，王 萍

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

龍葵果花色苷的分離與鑒定

騰 飛，鄭 悅，王 萍*

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

采用硅膠柱層析技術(shù)分離制備龍葵果花色苷。分離得到的2 個(gè)花色苷餾分經(jīng)紫外-可見(jiàn)光譜、高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography electrosprary ionization-mass spectrometry，HPLC-DADESI-MS/MS）進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并結(jié)合酸水解分析糖苷種類(lèi)。最終確定餾分Ⅰ為飛燕草素-3-琥珀酰阿拉伯糖苷，根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算其純度為94%；餾分Ⅱ?yàn)槭杠?chē)菊素-3-半乳糖苷和矢車(chē)菊素-3-乙酰半乳糖苷，峰面積歸一化法計(jì)算其純度分別為45.67%和13.97%。

龍葵；花色苷；分離；鑒定；高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用；酸水解

龍葵（Solanum nigrum L.）為一年生草本植物，屬于茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum），又名黑星星、黑呦呦、黑天天、野葡萄等。龍葵全草高30～120 cm，白色聚傘花序，球形漿果，其果實(shí)未成熟時(shí)為綠色，成熟后為黑紫色[1]。龍葵全草含礦物質(zhì)、氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有苷類(lèi)甾體生物堿、多糖、酯、酚類(lèi)化合物和皂苷等活性成分[2]。龍葵在全國(guó)范圍內(nèi)均有分布，且已有成熟的栽培技術(shù)。成熟的龍葵果含有豐富的紅色素，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的資源[3]。龍葵全草均可入藥，研究發(fā)現(xiàn)龍葵具有抗腫瘤，抗菌和抗病毒，抗炎與抗休克等功能，同時(shí)還對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)有藥理作用[4]。

目前對(duì)龍葵的研究大多集中在對(duì)龍葵生物堿和多糖的研究[5]，而對(duì)龍葵色素的研究起步較晚。目前已開(kāi)展了對(duì)該色素提取及穩(wěn)定性方面的研究，張賀等[6]通過(guò)正交試驗(yàn)確定龍葵果紅色素提取最優(yōu)工藝，建立了以提取溫度、提取時(shí)間為影響因素的提取龍葵果紅色素影響因素統(tǒng)計(jì)模型。范翠麗等[7]研究了常溫提取、水浴鍋熱提取、微波輔助提取和超聲波輔助提取對(duì)龍葵果色素的影響，并對(duì)龍葵果紅色素的浸提條件及浸提方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究，篩選出龍葵果紅色素的最佳提取方法及工藝條件。木合塔爾·吐?tīng)柕萚8]研究了戈壁野生龍葵果紫紅色素的提取條件和理化性質(zhì)，得出該色素在酸性條件下具有較好的穩(wěn)定性，并且對(duì)光、熱和常用食品添加劑都比較穩(wěn)定。然而對(duì)于龍葵花色苷的成分及結(jié)構(gòu)還未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)利用柱層析將龍葵果花色苷分離，并采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（high performance liquid chromatography electrosprary ionization-mass spectrometry，HPLC-DAD-ESI-MS/MS）對(duì)分離得到的龍葵果花色苷分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，為開(kāi)發(fā)和綜合利用龍葵資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍葵果于2014年9月采于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，采摘的新鮮龍葵果于－18 ℃冷凍保藏。

甲醇（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；純凈水 娃哈哈集團(tuán)；D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖、L-阿拉伯糖（色譜純） 上海源葉生物技術(shù)有限公司；柱層析硅膠（200～300 目） 青島海洋化工廠；X-5大孔樹(shù)脂 南開(kāi)大學(xué)化工廠；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100型高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent1260型高效液相色譜儀（配有示差折光檢測(cè)器）、Agilent Plus C18色譜柱（150 mmh3.0 mm，1.8 μm） 美國(guó)安捷倫公司；氨基柱（250 mmh 4.6 mm，5.0 μm） 美國(guó)Waters公司；薄層層析板（5 cmh20 cm） 青島海洋化工廠；玻璃層析柱（1.0 cmh40 cm）、HL-2型恒流泵 上海精科試業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

[5,9]，準(zhǔn)確稱取龍葵鮮果，按1∶25的料液比（m/V）用pH1.0，體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇室溫浸提3 次，每次2 h。合并濾液，真空旋轉(zhuǎn)濃縮除去乙醇，過(guò)X-5大孔吸附樹(shù)脂，用蒸餾水洗脫以除去糖、氨基酸等物質(zhì)，用手持糖量計(jì)檢測(cè)無(wú)可溶性固形物后再用pH 2.0，體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后得龍葵果花色苷精制物，冷藏備用。

1.3.2 展開(kāi)劑的篩選

分別在11 種展開(kāi)系統(tǒng)中進(jìn)行薄層層析實(shí)驗(yàn)，選擇適合分離龍葵果花色苷的展開(kāi)劑系統(tǒng)，展開(kāi)劑系統(tǒng)的組成見(jiàn)表1。

表1 不同展開(kāi)劑的組成Table 1 Composition of different developers

1.3.3 硅膠柱層析分離龍葵果花色苷

稱取25.0 g硅膠濕法裝柱，濕法上樣后用薄層層析選擇的最佳展開(kāi)劑進(jìn)行洗脫，分別收集不同顏色的洗脫液，利用薄層層析檢驗(yàn)相同餾分并合并，40 ℃條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑旋出[10]。

1.3.4 高效液相色譜條件

將分離得到的餾分真空濃縮后用體積分?jǐn)?shù)為0.1%冰乙酸甲醇溶液溶解后，過(guò)0.45 μm濾膜。參照Simirgiosts等[11]的方法并做適當(dāng)修改，得到色譜條件為：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（150 mmh3.0 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A：0.1%冰乙酸溶液，流動(dòng)相B：甲醇；洗脫流速為0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。線性梯度洗脫條件：0～3 min，10%～50% B；3～5 min，50%～85% B；5～8 min，85%～10% B；9～12 min，10% B等度洗脫。

1.3.5 質(zhì)譜條件

參照Lee等[12]的方法并做適當(dāng)修改，采用HPLCDAD-ESI-MS/MS技術(shù)電噴霧電離離子源（electrospray ionization，ESI），霧化氣壓35 psi；干燥氣體氮?dú)饬魉?0.0 L/min；干燥氣體溫度300 ℃；毛細(xì)管電壓4 000 V；碎裂電壓110 V；碰撞能量5～45 V；采用正離子模式，在m/z 100～1 000范圍內(nèi)掃描。

1.3.6 花色苷的糖苷類(lèi)型分析

將分離得到的花色苷餾分溶解于2 mol/L的HCl中，100 ℃回流提取2 h，得到棕色溶液后，用異戊醇萃取直至水層無(wú)色[13]。異戊醇層為花色苷苷元，水層則為水解得到的糖苷。將水解得到的糖苷濃縮后用乙腈溶解并過(guò)0.45 μm濾膜。用配有示差折光檢測(cè)器的Agilent1260型高效液相色譜儀分析。色譜條件為：Waters氨基柱（250 mmh4.6 mm，5.0 μm），柱溫35 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水（75∶25，V/V），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。用質(zhì)量濃度均為10.0 mg/mL的D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖和L-阿拉伯糖溶液做標(biāo)準(zhǔn)品[14]。

1.3.7 糖苷鍵位置的測(cè)定

取適量分離得到的花色苷餾分，以相應(yīng)展開(kāi)劑做空白，用紫外分光光度儀于200～700 nm進(jìn)行光譜掃描，測(cè)其最大吸收峰和在440 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算

圖1 餾分Ⅰ紫外吸收光譜圖Fig.1 UV spectrum of fraction Ⅰ

2 結(jié)果與分析

2.1 展開(kāi)劑的篩選結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)選擇常見(jiàn)花色苷的展開(kāi)體系對(duì)龍葵果花色苷進(jìn)行分離，結(jié)果如表2所示。

表2 不同展開(kāi)劑的展開(kāi)效果Table 2 Efficiency of different developers

由表2可知，BAW3（V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（水）=4∶1∶3）為最優(yōu)展開(kāi)劑。用薄層色譜法分離龍葵果花色苷時(shí)，用BAW3展開(kāi)出現(xiàn)3 條色帶，各色帶在色譜上的比移值（Rf）見(jiàn)表3。

表3 龍葵果花色苷薄層色譜分離的Rf值Table 3Rf values of Solanum nigrum L. anthocyanins

由表3可知，中間色帶和下色帶為主要花色苷，上色帶顏色很淺表現(xiàn)為黃色，經(jīng)檢驗(yàn)為非花色苷物質(zhì)，因此不做進(jìn)一步研究。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

將硅膠柱層析分段洗脫得到的餾分薄層層析點(diǎn)樣，合并相同餾分后得到餾分Ⅰ和餾分Ⅱ。對(duì)餾分Ⅰ和餾分Ⅱ做紫外全波長(zhǎng)掃描。由圖1、2可知，餾分Ⅰ的最大吸收波長(zhǎng)在547 nm和321 nm處，餾分Ⅱ的最大吸收波長(zhǎng)在525 nm和315 nm處。兩個(gè)花色苷餾分均在300～330 nm處有吸收峰，說(shuō)明花色苷分子內(nèi)有酰基[15]。

圖2 餾分Ⅱ紫外吸收光譜圖Fig.2 UV spectrum of fraction Ⅱ

2.3 HPLC-DAD-ESI-MS/MS檢測(cè)結(jié)果與分析

餾分Ⅰ經(jīng)過(guò)HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析得到總離子流圖和質(zhì)譜圖。由圖3可知，餾分Ⅰ共有3 個(gè)峰，峰1和峰2經(jīng)質(zhì)譜分析為非花色苷類(lèi)物質(zhì)，峰3為花色苷類(lèi)物質(zhì)。

圖3 餾分Ⅰ的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of fraction Ⅰ

由圖3可知，餾分Ⅰ只有一個(gè)主要峰（峰3），出峰時(shí)間為2.09 min，峰面積為3 607，峰面積歸一化法計(jì)算得出峰3占餾分Ⅰ含量為94%。由圖4a可知，該物質(zhì)的分子離子峰[M+H]+的質(zhì)荷比（m/z）為537，由圖4b可知其中一個(gè)碎片離子的m/z為436，二者相差一個(gè)質(zhì)荷比為100的基團(tuán)，根據(jù)da Silva等[16]研究該基團(tuán)為琥珀酸。此外圖1顯示餾分Ⅰ在321 nm處有一個(gè)尖峰，Escribano-Bailón等[15]研究認(rèn)為若花色苷分子有?；鶊F(tuán)，則在300～330 nm處會(huì)存在一個(gè)尖峰。另一個(gè)碎片離子[M+H]+的m/z為304對(duì)應(yīng)6種花色素中的飛燕草素，與碎片離子m/z 436相比又丟失了一個(gè)m/z為132的基團(tuán)，即為戊糖苷，由此推斷該物質(zhì)為飛燕草素的衍生物，可能是飛燕草素-3-琥珀酰戊糖苷[16]。

圖4 餾分Ⅰ的質(zhì)譜圖Fig.4 Molecular ion and fragment ion mass spectra of fraction I

圖5 餾分Ⅱ的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of fraction Ⅱ

餾分Ⅱ經(jīng)HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析得到總離子流圖和質(zhì)譜圖。由圖5可知，該餾分有3 種物質(zhì)，分別為峰1、峰2、峰3，出峰時(shí)間分別為3.05、3.97、6.78 min。其中峰1經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描和二級(jí)質(zhì)譜分析后顯示為非花色苷類(lèi)物質(zhì)，因此不做進(jìn)一步的研究。

圖6 餾分Ⅱ的質(zhì)譜圖Fig.6 Molecular ion and fragment ion mass spectra of fraction Ⅱ

由圖5可知，峰2的出峰時(shí)間為3.97 min，峰面積歸一化法計(jì)算得出相對(duì)餾分Ⅱ含量為45.67%，由圖6a可知，該物質(zhì)分子離子峰[M]+的m/z為449，圖6b顯示其碎片離子峰[M]+的m/z為287，二者相差162，為己糖脫去一分子水所得，這是典型的矢車(chē)菊素-3-己糖苷的質(zhì)譜信息[17-18]。峰3的出峰時(shí)間為6.78 min，峰面積歸一化法計(jì)算得出相對(duì)餾分Ⅱ含量為13.97%，由圖6c可知，此物質(zhì)分子離子峰[M]+的m/z為492，碎片離子的m/z為287，表明該物質(zhì)為矢車(chē)菊素的衍生物，二者m/z相差205為乙酰己糖脫去一分子水所得，因此推斷該物質(zhì)為矢車(chē)菊素-3-乙酰己糖苷[18]，在315 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)的尖峰也證實(shí)了?；拇嬖赱19]。

2.4 花色苷糖苷類(lèi)型的分析

圖7 餾分Ⅰ糖苷（a）與阿拉伯糖（b）的色譜圖Fig.7 HPLC-RID chromatogram of fraction Ⅰ (a) and arabinose (b)

市售的花色苷標(biāo)準(zhǔn)品種類(lèi)不全，此外花色苷的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致購(gòu)買(mǎi)標(biāo)準(zhǔn)品分析花色苷的組成可行性不大。因此，經(jīng)常采用將其酸水解后，分別分析花色苷的苷元和糖苷的方法。由圖7、8可知，餾分Ⅰ中糖苷出峰時(shí)間為5.041 min，餾分Ⅱ中糖苷出峰時(shí)間為5.821 min。標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間分別為D-葡萄糖5.643 min、D-半乳糖為5.858 min、果糖5.288 min、L-鼠李糖4.442 min、D-甘露糖5.416 min、D-木糖4.806 min、L-阿拉伯糖5.089 min。由此推測(cè)餾分Ⅰ攜帶的糖苷為L(zhǎng)-阿拉伯糖，餾分Ⅱ所攜帶糖苷為D-半乳糖。

圖8 餾分Ⅱ糖苷（a）與半乳糖（b）的色譜圖Fig.8 HPLC-RID chromatogram of fraction Ⅱ (a) and galactose (b)

2.5 花色苷糖苷鍵位置的確定

餾分Ⅰ和餾分Ⅱ的A440nm/Amax分別為18.5%和25%，證明糖苷鍵的位置在C3位[20]。該糖基可與有機(jī)酸發(fā)生?；磻?yīng)，常見(jiàn)的芳香酸有p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、沒(méi)食子酸或p-羥基苯甲酸；脂肪酸有丙二酸、醋酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸或草酸等。這些酸通常與C環(huán)3位上糖基的6位羥基或者少數(shù)也與4位羥基發(fā)生?；痆21]。因此，推斷餾分Ⅰ為飛燕草素-3-琥珀酰阿拉伯糖苷，餾分Ⅱ包含2 種花色苷，分別為矢車(chē)菊素-3-半乳糖苷和矢車(chē)菊素-3-乙酰半乳糖苷。

3 結(jié) 論

花色苷作為替代化學(xué)合成的食品著色劑已經(jīng)受到了社會(huì)各界的高度關(guān)注，然而，花色苷在食品加工、運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中所表現(xiàn)出的極不穩(wěn)定性限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。研究顯示?；幕ㄉ赵趐H值變化、溫度升高和光照存在時(shí)表現(xiàn)出了比非?；幕ㄉ崭玫姆€(wěn)定性[21]。因此，?；幕ㄉ沼兄訌V泛的應(yīng)用[22]。?；幕ㄉ諒V泛存在于水蘿卜、紅薯、紫甘薯、紅甘藍(lán)和黑胡蘿卜中。Correa-Betanzo等[23]分析了野生藍(lán)莓中的12 種花色苷，結(jié)果僅有2 種為?；幕ㄉ?。Wu Xiangyang等[24]在桑葚中分離得到4 種花色苷，僅有1 種為?；幕ㄉ?。在草莓和紅樹(shù)莓中則不存在酰化的花色苷[25-26]。而本實(shí)驗(yàn)則找到了一種富含酰化花色苷的來(lái)源廣泛價(jià)格低廉的植物原料。

經(jīng)硅膠柱層析分離得到2 個(gè)花色苷餾分，通過(guò)HPLCDAD-ESI-MS/MS分析，餾分Ⅰ為單體花色苷，峰面積歸一化法計(jì)算得出純度為94%，推斷為飛燕草素-3-琥珀酰阿拉伯糖苷；餾分Ⅱ包含2 種花色苷分別為矢車(chē)菊素-3-半乳糖苷和矢車(chē)菊素-3-乙酰半乳糖苷，峰面積歸一化法計(jì)算二者總含量占餾分Ⅱ的59.64%。此分離方法簡(jiǎn)便易行，為龍葵的精深加工提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Isolation and Identification of Anthocyanins from Solanum nigrum L. Fruits

TENG Fei, ZHENG Yue, WANG Ping*
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The objective of this study was to isolate anthocyanins from Solanum nigrum L. fruits by silica gel column chromatography and identify them by UV-visible spectroscopy and high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Acid hydrolysis was applied for the identification of glucosides. Three anthocyanins were identified for the first time in Solanum nigrum L. fruits. Only delphinidin-3-succinylarabinoside was detected in fraction I (the purity was 94%), while both cyanidin-3-galactoside (the purity was 45.67%) and cyanidin-3-acetylgalactoside (the purity was 13.97%) were found to be present in fraction II. The presented method is simple and reliable to isolate and identify the anthocyanins from Solanum nigrum L. fruits.

Solanum nigrum L.; anthocyanins; isolation; identification; high performance liquid chromatography electrosprary ionization-mass spectrometry (HPLC-DAD-ESI-MS/MS); acid hydrolysis

10.7506/spkx1002-6630-201607011

TS201.1

A

1002-6630（2016）07-0056-06

騰飛, 鄭悅, 王萍. 龍葵果花色苷的分離與鑒定[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 56-61. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607011. http://www.spkx.net.cn

TENG Fei， ZHENG Yue， WANG Ping. Isolation and identification of anthocyanins from Solanum nigrum L. fruits[J]. Food Science, 2016, 37(7): 56-61. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607011. http://www.spkx.net.cn

2015-05-11

黑龍江省卓越農(nóng)林人才教育培養(yǎng)計(jì)劃改革試點(diǎn)項(xiàng)目（41110211）

騰飛（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)楣δ苁称贰-mail：tengfeisiyu@126.com

*通信作者：王萍（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锘钚猿煞痔崛〖肮δ堋-mail：wangpingnefu@126.com