陸　遠(yuǎn)　趙　霞

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京，210023)

?

固本防哮飲對哮喘緩解期小鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡基因CRT和EDEM的影響

陸遠(yuǎn)趙霞

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京，210023)

目的：探討中藥復(fù)方固本防哮飲對哮喘緩解期小鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡基因CRT和EDEM的影響。方法：結(jié)合前期研究采用卵蛋白(OVA)致敏和OVA-呼吸道合胞病毒(RSV)聯(lián)合誘導(dǎo)激發(fā)BALB/c雌性小鼠，建立哮喘緩解期動(dòng)物模型，隨機(jī)分為正常組，模型組，固本防哮飲低、中、高劑量組，孟魯司特鈉組及地塞米松組。Real-time PCR法檢測肺組織中EDEM和CRT mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：模型組小鼠肺組織中CRT表達(dá)顯著高于正常組(P<0.05)；固本防哮飲高、中劑量組，孟魯司特鈉組及地塞米松組小鼠肺組織中CRT mRNA表達(dá)均顯著低于模型組(P<0.05)，而EDEM在各組中表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：固本防哮飲防治哮喘減輕慢性氣道炎性反應(yīng)的作用機(jī)制可能是通過抑制蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)相關(guān)的凋亡基因CRT表達(dá)所致。

固本防哮飲；哮喘緩解期；蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)；CRT；EDEM

哮喘是以廣泛多變的可逆性氣道阻塞、非特異性氣道高反應(yīng)、慢性氣道炎性反應(yīng)為特征的異質(zhì)性疾病，具有喘息、氣促、胸悶和咳嗽的呼吸道癥狀，其強(qiáng)度可隨時(shí)間而變化[1]。慢性氣道炎性反應(yīng)貫穿于哮喘的典型癥狀中，是研究哮喘有效治療手段的主要挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)即使在沒有典型臨床癥狀或肺功能正常的哮喘緩解期患者中，慢性氣道炎性反應(yīng)依然普遍存在[2]。雖然近年來吸入性糖皮質(zhì)激素等抗炎藥物已提升了哮喘癥狀的控制率，但糖皮質(zhì)激素存在的多種不良反應(yīng)限制了其成為哮喘治愈藥物的可能,因此亟需更安全且有效的替代治療藥物。中醫(yī)藥重視整體觀念，祛除外邪的同時(shí)強(qiáng)調(diào)扶正固本，是防治哮喘的理想療法。固本防哮飲為我國著名中醫(yī)兒科專家江育仁教授的經(jīng)驗(yàn)方，由玉屏風(fēng)散合二陳湯加減而來，具有益氣固表，健脾化痰的作用，臨床運(yùn)用多年治療哮喘安全有效并可減少復(fù)發(fā)率[3]。前期課題組發(fā)現(xiàn)固本防哮飲可顯著抑制哮喘易感基因ORMDL3在哮喘緩解期小鼠模型中的表達(dá)[4]。ORMDL3作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum stress，ERS)下蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)(Unfolded Protein Response，UPR)的誘導(dǎo)因子，參與了由蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)介導(dǎo)的哮喘慢性氣道炎性反應(yīng)和氣道重塑的過程[5]。因此，本研究試圖研究固本防哮飲對蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)下游細(xì)胞凋亡相關(guān)基因—CRT(Calreticulin)和EDEM(ER degradation enhancing mannosidase like-protein)的影響，探討固本防哮飲對抑制哮喘緩解期慢性氣道炎性反應(yīng)的作用機(jī)制。

1　材料

1.1動(dòng)物清潔級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，質(zhì)量18～22 g，購于昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動(dòng)物許可證號：SCXK(蘇)2013-0003。

1.2藥物孟魯司特鈉片：10 mg/片，由杭州默沙東藥業(yè)股份有限公司提供，生產(chǎn)批號：K004567。地塞米松片：0.75 mg/片，由辰飲藥業(yè)股份有限公司提供，生產(chǎn)批號：121203203。固本防哮飲：由炙黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、煅牡蠣、蟬蛻、陳皮、防風(fēng)、辛夷、五味子和生甘草等11味藥組成，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)教研室鑒定其均為正品，按5∶3.33∶3.33∶3.33∶5∶2∶2∶1∶2∶2∶1的比例配伍，先取8倍量冷水浸藥30 min，煎30 min(沸后)，濾過；第2煎加6倍量水煎30 min，將2次煎液過濾合并濃縮，分別調(diào)至含生藥3 g/mL的溶液，密封于無菌量瓶，4 ℃儲存?zhèn)溆?。卵蛋?ovalbumin，OVA)購于美國Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清購于Gibco公司。人喉癌上皮細(xì)胞(HEP-2)和呼吸道合胞病毒A2型(Long株)由江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3試劑Trizol：美國Invitrogen公司；DEPC：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：大連Takara公司；Real time PCR定量試劑盒：大連Takara公司。

2　方法

2.1呼吸道合胞病毒(RSV)制備及病毒毒力測試

1)病毒制備：以人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2)為宿主擴(kuò)增呼吸道合胞病毒A2型(Long株)，細(xì)胞培養(yǎng)及RSV擴(kuò)增Hep-2采用含10%小牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。采用對數(shù)生長期細(xì)胞，Hep-2以每孔1.5～2×105/ L接種2孔板，匯合至單層后棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，接種病毒液200 μL，吸附1.5 h。加入適量含2%小牛血清的維持液繼續(xù)培養(yǎng)3～5d。待融合病變達(dá)80%以上，反復(fù)凍融3次，離心收集上清(即病毒液)，分裝后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)病毒毒力測試：以細(xì)胞病變法測定RSV對Hep-2的半數(shù)感染量(TCID50)，Hep-2接種于96孔板，待長成單層時(shí)，除正常細(xì)胞對照組外，接種各稀釋度的病毒液(用維持液10倍梯度稀釋8個(gè)濃度)。吸附1.5 h后，棄病毒液并換含2%胎牛血清的維持液繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察病變程度并記錄，以最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變時(shí)為終點(diǎn)。Reed-Muench公式計(jì)算病毒TCID50，本次實(shí)驗(yàn)中使用的RSV的毒力為104.167TCID50/mL。

2.2造模、分組及給藥參照前期研究造模方法[4]，加以改進(jìn)制備哮喘緩解期動(dòng)物模型。小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，第1、8天將除正常組外的小鼠給予腹腔注射0.2 mL致敏液(其中包含OVA 100 μg，硫酸鋁鉀1 mg，溶解于生理鹽水中)致敏，第15天時(shí)將小鼠放入霧化器的有機(jī)玻璃盒中，以2.5%OVA溶解于生理鹽水中霧化吸入30 min激發(fā)，連續(xù)霧化14d，1次/d。第32～54天以同樣的方法每隔2d霧化激發(fā)1次，每次均為30 min共22次，期間在第29、42、55天時(shí)分別以RSV 50 μL/只滴鼻誘導(dǎo)激發(fā)。正常組均以同體積生理鹽水代替OVA溶液致敏、RSV滴鼻誘導(dǎo)激發(fā)。末次激發(fā)后(第56天)，將除正常組外的小鼠分為模型組(蒸餾水20 mL/kg)、孟魯司特鈉組(2.6 mg/kg)、地塞米松組(1 mg/kg)、固本防哮飲高劑量組(36 g/kg)、固本防哮飲中劑量組(24 g/kg)、固本防哮飲低劑量組(18 g/kg)，灌胃1次/d，共30 d，正常組以等體積蒸餾水灌胃。末次給藥后24 h，麻醉脫頸椎處死小鼠，取肺組織放于液氮中，備用。

2.3Real-time PCR法檢測肺組織CRT和EDEM mRNA表達(dá)參照RNA抽提試劑盒說明書要求抽提總RNA。應(yīng)用紫外分光光度儀測定A260/A280比值及濃度，A260/A280比值在1.8～2.0之間為符合純度要求。依據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物[4]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列分別為CRT：正向引物：5′-GACTGGGATGAACGAGCCAA-3′和反向引物：5′-GGTTTCCACTCGCCCTTGTA-3′，產(chǎn)物長度179bp；EDEM：正向引物：5′-CCGGCGCTTCAAAATAATGCC-3′和反向引物：5′-CCGAAGACCAACCAGAGCAC-3′，引物長度112bp。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，對已提取的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０凑赵噭┖姓f明書進(jìn)行操作擴(kuò)增。采用2ˉ△△CT對實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料采用Mean±SEM表示，數(shù)據(jù)處理和作圖采用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett′s post hoc法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

固本防哮飲對小鼠肺組織中CRT和EDEM mRNA表達(dá)的影響。由圖1可知，模型組小鼠肺組織中CRT表達(dá)顯著高于正常組(P<0.05)；固本防哮飲高、中劑量組，孟魯司特鈉組和地塞米松組小鼠肺組織中CRT mRNA表達(dá)均顯著低于模型組(P<0.05)，而EDEM在各組中mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1　(a-b)各組小鼠CRT和EDEM mRNA相對表達(dá)量(Mean±SEM)

注：A-正常組；B-模型組；C-固本防哮飲高劑量組；D-固本防哮飲中劑量組；E-固本防哮飲低劑量組；F-孟魯司特鈉組；G-地塞米松組。

4　討論

哮喘患病率呈逐年上升趨勢，據(jù)WHO調(diào)查報(bào)道顯示全球范圍內(nèi)已有超過3億的哮喘患者。目前西醫(yī)控制和預(yù)防哮喘發(fā)作的一線用藥為霧化吸入糖皮質(zhì)激素聯(lián)合長效β2受體激動(dòng)劑。糖皮質(zhì)激素可通過抑制上皮來源的多種細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子減輕慢性氣道炎性反應(yīng)，但約有10%患者屬于以中性粒細(xì)胞占主導(dǎo)的難治性哮喘[6]，該類患者對吸入性糖皮質(zhì)激素并不敏感，同時(shí)長期吸入糖皮質(zhì)激素的遠(yuǎn)期療效并不優(yōu)于安慰劑，而且會降低兒童骨骼中礦物質(zhì)含量[23]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負(fù)責(zé)細(xì)胞中多種蛋白質(zhì)折疊、合成、轉(zhuǎn)運(yùn)的主要細(xì)胞器，其理化性質(zhì)和分子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的穩(wěn)定是正確合成蛋白質(zhì)的重要條件。當(dāng)各種因素刺激下使蛋白質(zhì)正常折疊量超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會處于應(yīng)激狀態(tài)并啟動(dòng)一種名為蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)的適應(yīng)性反應(yīng)，從而產(chǎn)生并累積錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)分泌和降解相關(guān)通道功能和結(jié)構(gòu)的完整性使分子轉(zhuǎn)運(yùn)處于正常狀態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身適應(yīng)能力的失調(diào)或在各種干擾條件下，均能損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常生理功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的出現(xiàn)。近年來，多項(xiàng)研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了多種慢性疾病的病理機(jī)制[8]，以呼吸系統(tǒng)疾病為例，環(huán)境中煙霧、汽車尾氣和多種吸入性抗原被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和失平衡的重要誘因，研究證實(shí)支氣管哮喘中慢性氣道炎性反應(yīng)與長期存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)密切相關(guān)[9]。同時(shí)，氣道上皮細(xì)胞以及炎性細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)的啟動(dòng)是糖皮質(zhì)激素抵抗型哮喘等重癥哮喘的重要病理機(jī)制[10]。

真核生物包括從酵母到人類的種族跨度在內(nèi)，典型的蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)由位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3種跨膜受體蛋白所調(diào)控[11]：需肌醇酶1(Inositol Requiring Enzyme 1，IRE1α)，轉(zhuǎn)錄激活因子6(Activating Transcription Factor 6，ATF6)，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Double-stranded RNA-activated Protein Kinase-like ER Kinase，PERK)。靜息狀態(tài)下，分子伴侶蛋白又稱為結(jié)合免疫球蛋白(Binding Immunoglobulin Protein，BIP)/葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated Protein 78，GRP78)，與以上3種跨膜受體蛋白相結(jié)合，使其處于失活狀態(tài)[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)殘片的增加，會使BIP從3種跨膜受體蛋白上分離，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。IRE1α和PERK受體的激活使其結(jié)構(gòu)發(fā)生二聚化和自身磷酸化，而ATF6需要被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體中才可被激活[7]。目前在不同的細(xì)胞內(nèi)條件環(huán)境下，蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)中不同通路所扮演的角色并未明確。呼吸系統(tǒng)中誘發(fā)蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要外源性物質(zhì)有香煙、空降顆粒物、細(xì)菌感染、病毒、屋塵螨、卵清蛋白等[9]。1)近期研究顯示支氣管哮喘中蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與主要產(chǎn)生活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)、一氧化氮的炎性反應(yīng)信號通路網(wǎng)絡(luò)緊密聯(lián)系[13-14]。三條傳統(tǒng)蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)通路與NF-κB經(jīng)典炎性反應(yīng)通路密切相關(guān)，ATF6與NF-κB-IKK信號通路相連[15]，PERK-eIF2α通過抑制IκB的翻譯促進(jìn)炎性反應(yīng)因子表達(dá)并同時(shí)讓過多游離的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，激活的IRE1α可重新聚集IKK并促進(jìn)NF-κB調(diào)控的炎性反應(yīng)。中性粒細(xì)胞占主導(dǎo)的哮喘存在不同程度的糖皮質(zhì)激素抵抗，糖皮質(zhì)激素對該類哮喘氣道上皮細(xì)胞和炎性反應(yīng)細(xì)胞中NF-κB炎性反應(yīng)通路無效，而利用ERS或UPR阻斷劑可能具有對糖皮質(zhì)激素抵抗的反轉(zhuǎn)作用[16]。2)過敏原暴露下，IRE1β可通過XBP1提高粘蛋白MUC5AC表達(dá)[17]，另可誘導(dǎo)與杯狀細(xì)胞分化和蛋白糖基化基因，促進(jìn)杯狀細(xì)胞表型分化，提示IRE1β的激活可能參與了哮喘氣道高分泌的過程。3)哮喘易感基因ORMDL3可調(diào)控蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)，主要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵(Sarcoendoplasmic Reticulum Ca2+ATPase Pump，SERCA)調(diào)節(jié)鈣離子平衡,減少磷酸化eIF2A的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷增加[5]。ORMDL3還可通過激活A(yù)TF6調(diào)控SERCA，而SERCA表達(dá)的減少與哮喘氣道重塑密切相關(guān)[18]。4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在免疫中也具有重要作用，研究證實(shí)XBP1是血漿B細(xì)胞的起始轉(zhuǎn)錄因子[19]，蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)對樹突細(xì)胞分化和生存起到重要作用[20]。以上研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)與哮喘氣道炎性反應(yīng)、高分泌、重塑以及自身免疫等多方面均密切相關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解和細(xì)胞凋亡的重要途徑。1)IRE1α是進(jìn)化意義上最古老以及最保守的蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)分支通路，擁有2個(gè)活躍的激酶和核糖核酸內(nèi)切酶，而其核糖核酸內(nèi)切酶促使mRNA編碼轉(zhuǎn)錄因子X箱式結(jié)合蛋白1(X-box-binding Protein 1，XBP1)翻譯為活化的形式XBP1s。XBP1s可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成、磷脂合成和凋亡位點(diǎn)EDEM涉及的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解過程(ER-associated Degradation，ERAD)。2)活化后的ATF6屬于從高爾基體釋放的胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，可提高對ERAD和XBP1基因編碼轉(zhuǎn)錄[21]。3)PERK可使真核起始轉(zhuǎn)錄因子2α(Eukaryotic Translational Initiation Factor 2α，eIF2α)磷酸化為eIF2β，減少高爾基體蛋白質(zhì)合成從而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷[21]。此外，PERK還可通過ATF4等重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[22]。雖然，蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)是細(xì)胞的一種適應(yīng)性反應(yīng)，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)本身并非每次均能從應(yīng)激狀態(tài)恢復(fù)至正常，持續(xù)和嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)可通過以上三條傳統(tǒng)蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。CRT可通過PERK受體蛋白調(diào)控免疫原性細(xì)胞死亡[23-25]，樹突細(xì)胞可通過識別遷移至細(xì)胞膜表面CRT而對已死亡的細(xì)胞進(jìn)行處理[26]。

本研究發(fā)現(xiàn)固本防哮飲對蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)中凋亡相關(guān)基因CRT存在抑制作用，可能是其減輕哮喘慢性氣道炎性反應(yīng)的作用機(jī)制。然而，CRT和EDEM對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下蛋白質(zhì)未折疊反應(yīng)參與的哮喘病理生理過程，以及對固本防哮飲防治哮喘作用機(jī)制中扮演的具體地位仍然需要更多深入研究進(jìn)行驗(yàn)證。

[1]Global Initiative for Asthma.Global strategy for asthma management and prevention.[EB/OL].Revised，2014.(Assessed May 2014，at www.ginasthma.org.).

[2]Broekema M，Volbeda F，Timens W，et al.Airway eosinophilia in remission and progression of asthma：accumulation with a fast decline of FEV(1)[J].Respir Med，2010，104(9)：1254-1262.

[3]袁雪晶，孫軼秋.固本防哮飲聯(lián)合穴位敷貼治療兒童哮喘緩解期100例臨床研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(12)：2306-2309.

[4]Huang Z，Gao L，Zhao X，et al.Effect of Gubenfangxiao decoction on respiratory syncytial virus-induced asthma and expression of asthma susceptibility gene orosomucoid 1-like protein 3 in mice [J].Journal of traditional Chinese medicine，2016，36(1)：101-106.

[5]Cantero-Recasens G，F(xiàn)andos C，Rubio-Moscardo F，et al.The asthma-associated ORMDL3 gene product regulates endoplasmic reticulum-mediated calcium signaling and cellular stress [J].Hum Mol Genet，2010，19(1)：111-121.

[6]McGrath KW，Icitovic N，Boushey HA，et al.A large subgroup of mild-to-moderate asthma is persistently noneosinophilic [J].Am J Respir Crit Care Med，2012，185(6)：612-619.

[7]Ron D，Walter P.Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response [J].Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(7)：519-529.

[8]Toth A，Nickson P,Mandl A，et al.Endoplasmic reticulum stress as a novel therapeutic target in heart diseases [J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2007，7(3)：205-218.

[9]Osorio F，Lambrecht B，Janssens S.The UPR and lung disease [J].Semin Immunopathol，2013，35(3)，293-306.

[10]Kim SR，Kim DI，Kang MR，et al.Endoplasmic reticulum stress influences bronchial asthma pathogenesis by modulating nuclear factor κB activation [J].J Allergy Clin Immunol，2013，132(6)：1397-1408.

[11]Hetz C.The unfolded protein response：controlling cell fate decisions under ER stress and beyond [J].Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13(2)：89-102.

[12]Bertolotti A，Zhang Y，Hendershot LM，et al.Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response [J].Nat Cell Biol，2000，2(6)：326-332.

[13]Cullinan SB，Diehl JA.Coordination of ER and oxidative stress signaling：the PERK/Nrf2 signaling pathway [J].Int J Biochem Cell Biol，2006，38(3)：317-332.

[14]Gotoh T，Mori M.Nitric oxide and endoplasmic reticulum stress [J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(7)：1439-1446.

[15]Yamazaki H，Hiramatsu N，Hayakawa K.et al.Activation of the Akt-NF-kappaB pathway by subtilase cytotoxin through the ATF6 branch of the unfolded protein response [J].J Immunol，2009，183(2)：1480-1487.[16]Kim HJ，Jeong JS，Kim SR，et al.Inhibition of endoplasmic reticulum stress alleviates lipopolysaccharide-induced lung inflammation through modulation of NF-κB/HIF-1α signaling pathway [J].Sci Rep，2013，3：1142.

[17]Martino ME，Olsen JC，F(xiàn)ulcher NB，et al.Airway epithelial inflammation-induced endoplasmic reticulum Ca2+store expansion is mediated by X-box binding protein-1 [J].J Biol Chem，2009，284(22)：14904-14913.

[18]Mahn K，Hirst SJ，Ying S，et al.Diminished sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase(SERCA)expression contributes to airway remodelling in bronchial asthma [J].Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(26)：10775-10780.

[19]Reimold AM，Iwakoshi NN，Manis J，et al.Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1 [J].Nature，2001，412(6844)：300-307.

[20]Iwakoshi NN，Pypaert M，Glimcher LH.The transcription factor XBP-1 is essential for the development and survival of dendritic cells [J].J Exp Med，2007，204(10)：2267-2275.

[21]Hotamisligil GS.Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease [J].Cell，2010，140(6)：900-917.

[22]DuRose JB，Scheuner D，Kaufman RJ，et al.Phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha coordinates rRNA transcription and translation inhibition during endoplasmic reticulum stress [J].Mol Cell Biol，2009，29(15)：4295-4307.

[23]Peters LR，Raghavan M.Endoplasmic reticulum calcium depletion impacts chaperone secretion，innate immunity，and phagocytic uptake of cells [J].J Immunol，2011，187(2)：919-931.

[24]Panaretakis T，Kepp O，Brockmeier U，et al.Mechanisms of pre-apoptotic calreticulin exposure in immunogenic cell death [J].EMBO J，2009，28(5)：578-590.

[25]Garg AD，Krysko DV，Verfaillie T，et al.A novel pathway combining calreticulin exposure and ATP secretion in immunogenic cancer cell death [J].EMBO J，2012，31(5)：1062-1079.

[26]Obeid M，Tesniere A，Ghiringhelli F，et al.Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death [J].Nat Med，2007，13(1)：54-61.

(2016-09-09收稿責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Effects of Gubenfangxiao Decoction on Lung Tissue ER Stress-associated Apoptotic Genes CRT and EDEM in Murine Asthmatic Remission Models

Lu Yuan，Zhao Xia

(Jiangsu Key Laboratory of Pediatric Respiratory Disease，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)

Objective:To explore the effects of Gubenfangxiao Decoction(GBFXD)on lung tissue ER stress-associated apoptotic gene CRT and EDEM in murine asthma remission models．Methods:According to former studies，OVA sensitization and RSV-OVA were used for stimulation and inducement on BALB/c female mice to build animal asthma remission models，which were then randomly grouped into normal group，model group，GBFXD high dose group，GBFXD medium dose group，GBFXD low dose group，Montelukast Sodium group and Dexamethasone group.The mRNA levels of ER stress-associated apoptotic genes CRT and EDEM were detected via RT-PCR method．Results:The lung tissue CRT expression of the model group is significantly higher than that of the normal group(P<0.05)； In GBFXD high dose group，GBFXD medium dose group，Montelukast Sodium group and Dexamethasone group，inhibited ER stress-associated apoptotic genes CRT were observed through the significant reduction of mRNA expressions after GBFXD treatment.(P<0.05)Conclusion:Guben Fangxiao Decoction significantly attenuates RSV-OVA-induced persistent airway inflammation in murine asthma remission model.These effects may be mediated，at least partially，by inhibiting the activation of ER stress-associated apoptotic genes CRT.

Guben Fangxiao Decoction； Asthma remission； Unfolded protein response； CRT； EDEM

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81473723)

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.003