齊英姿，鄧晨，蘇納，張令強，徐平

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肝癌細胞系Hep3B的泛素化蛋白質(zhì)組學

齊英姿，鄧晨，蘇納，張令強，徐平

軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室國家蛋白質(zhì)科學中心 (北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 102206

泛素化修飾是細胞內(nèi)最重要的翻譯后修飾形式之一，對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定、降解、定位以及生物活性的調(diào)節(jié)起到重要作用。但因其在細胞內(nèi)豐度低、降解周期短等特點而很難被檢測。本研究中，制備的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白 (Ubiquitin-binding domains，UBDs) 用于富集肝癌細胞系Hep3B中的泛素化蛋白，并通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的方法對富集的泛素化蛋白進行鑒定。實驗共鑒定到1 900個潛在的泛素化蛋白和158個泛素化位點，這些被鑒定到的泛素化位點分屬于102個蛋白。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白顯著富集的相關(guān)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，此結(jié)果暗示腫瘤細胞內(nèi)泛素化-蛋白酶體的失調(diào)與腫瘤細胞的信號傳導及細胞外基質(zhì)的變化等具有較高的關(guān)聯(lián)性。

Hep3B，蛋白質(zhì)組學，泛素化，ThUBDs

蛋白質(zhì)是組成細胞的基石，是細胞生命活動的最終執(zhí)行者。機體的正常功能的行使依賴于細胞內(nèi)眾多蛋白質(zhì)有條不紊地發(fā)揮著多種多樣的功能。真核細胞內(nèi)普遍存在著復雜的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，而正是這種質(zhì)量控制系統(tǒng)的存在，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)才能夠在復雜的體內(nèi)環(huán)境中生存，并正確地行使其功能。而在細胞內(nèi)這些不同層次的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾被認為是最為快速、高效、經(jīng)濟的調(diào)控方式，可迅速地調(diào)控細胞進程[1-4]。蛋白質(zhì)泛素化修飾是調(diào)控蛋白質(zhì)質(zhì)量的最重要的翻譯后修飾形式。細胞內(nèi)的泛素化修飾主要參與泛素-蛋白酶體途徑，執(zhí)行對細胞內(nèi)蛋白有序降解的功能，以此來保證翻譯過程中及翻譯后的折疊、裝配出現(xiàn)錯誤的或有害的蛋白質(zhì)被降解，避免對細胞產(chǎn)生毒害作用。泛素-蛋白酶體途徑是對蛋白質(zhì)具有高度選擇特異性的降解過程，而蛋白質(zhì)的降解又可調(diào)控其他細胞事件的進行，從而對一系列的細胞行為產(chǎn)生影響。

以泛素-蛋白酶體系統(tǒng)為代表的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)失調(diào)，會導致一系列疾病，如阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤的發(fā)生等[5]。在腫瘤發(fā)生過程中，這種調(diào)節(jié)機制的喪失會導致如抑癌蛋白的過量降解或癌蛋白降解途徑失效等，都會導致癌癥的發(fā)生。泛素蛋白酶體系統(tǒng)對p53、p27、分子伴侶、26S蛋白酶體等的調(diào)控均可影響腫瘤的發(fā)展進程[6-9]。肝細胞癌是嚴重威脅我國國計民生的重大疾病。世界范圍內(nèi)，肝細胞癌居于男性患者癌癥發(fā)病率第5位，死亡率第2位[10]。其顯著的誘因包括乙型肝炎病毒 (HBV) 的感染而引發(fā)的慢性肝炎。我國是HBV的高發(fā)區(qū)，因此HBV感染引發(fā)的細胞內(nèi)泛素蛋白酶體的變化及其肝細胞癌病機制也是基礎(chǔ)醫(yī)學研究應(yīng)當關(guān)注的重點。已有研究表明，HBV病毒中的一個獨特開放讀碼框所編碼的HBx蛋白可與蛋白酶體的亞基相互作用，作為轉(zhuǎn)錄輔助激活因子發(fā)揮其功能[11]。此功能可能是HBV作用于受體細胞的分子基礎(chǔ)之一。還有研究顯示HBx蛋白中有一段保守的肽鏈可下調(diào)p97表達量而降低蛋白酶體的活性，引起HepG2細胞的增殖減緩和凋亡[12]，這也為針對HBV引起的肝細胞癌的蛋白酶體抑制劑藥物的研制帶來希望。

與細胞內(nèi)大部分翻譯后修飾一樣，泛素化修飾也同樣具有豐度低、動態(tài)范圍大、降解快速及結(jié)構(gòu)較為復雜等問題，使得對其大規(guī)模鑒定和研究成為挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的泛素化富集方法主要通過在泛素鏈的末端引入親和標簽的技術(shù)來實現(xiàn)的。如Gygi實驗室[13]用His標簽對泛素進行標記，首次實現(xiàn)了質(zhì)譜技術(shù)對泛素化蛋白及位點的鑒定。隨后又發(fā)展了HB標簽、Flag標簽標記的方法等對細胞系、果蠅等樣品中泛素化蛋白及位點的鑒定[14-16]。但是，該方法應(yīng)用的樣本有限，尤其是不能應(yīng)用于組織樣本或病理標本，使得其在醫(yī)學研究范疇的應(yīng)用受到限制。此外，該方法還存在對泛素化位點的富集具有一定的選擇性，可能干擾細胞的正常功能，無法表征細胞內(nèi)真正的泛素化指標等缺點。而后，高親和抗體的方法也成功應(yīng)用于泛素化位點的富集[17-18]；該方法是基于泛素化蛋白經(jīng)胰酶酶解后會產(chǎn)生兩個甘氨酸殘基殘留的特點進行富集，優(yōu)點是富集的泛素化位點數(shù)及蛋白數(shù)較多，缺點是抗體高背景所帶來的非特異的污染蛋白多。而泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Ubiqutin-binding domains，UBDs) 也是可以識別和結(jié)合泛素化修飾的小蛋白，是進行泛素化富集的有效工具之一。本實驗室自主開發(fā)了串聯(lián)雜合UBD (Tandem hybrid UBD，ThUBDs) 的方法對生物樣本中的泛素化蛋白進行無偏向性的富集，該方法應(yīng)用范圍廣，可應(yīng)用于各種細胞系、動物組織及病理樣本的泛素化富集研究[19]。

本實驗利用ThUBDs富集泛素化蛋白與質(zhì)譜鑒定蛋白翻譯后修飾相結(jié)合的方法，對肝癌細胞系Hep3B中的泛素化蛋白進行富集和LC-MS/MS鑒定，我們共鑒定到1 900個潛在的泛素化蛋白和158個分屬于102個蛋白質(zhì)的泛素化位點。對1 900個潛在的泛素化蛋白進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要聚類于細胞內(nèi)或細胞間信號轉(zhuǎn)導通路、轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的胞間連接以及蛋白泛素化信號通路等，提示腫瘤細胞內(nèi)的泛素化-蛋白酶體的失調(diào)可能與細胞的癌癥特征的出現(xiàn)密切相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

肝癌細胞系Hep3B購于中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所北京協(xié)和細胞資源中心。細胞保存于含有體積比10%二甲基亞砜 (Dimethyl sulfoxide，DMSO) 以及50%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于液氮中保存。

1.1.2 小鼠品系

Balb/c小鼠，雌性，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。按照實驗動物的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇、培養(yǎng)和傳代

將細胞凍存管從液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴鍋中。待凍存管中的液體融化后，液體轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入4 mL培養(yǎng)基，常溫離心 (1 000 r/min，5 min)。棄上清，保留沉淀4 mL培養(yǎng)基將細胞沉淀重懸，置于37 ℃、5% CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

待貼壁生長的細胞達到80%?90%匯合度時，加入0.25%胰蛋白酶消化，待細胞形態(tài)開始收縮變形時，棄掉胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)基重懸細胞，按1∶2比例傳代接種于培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度37 ℃、5% CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞超聲破碎提取蛋白

收集的細胞沉淀加入3 mL裂解液 (PBS，10%甘油、1 mmol/L EDTA、0.5% 乙基苯基聚乙二醇 (Nonidet P 40，NP-40)、1×N-乙基馬來酰亞胺 (N-ethylmaleimide，NEM)、5 mmol/L IAA、1×蛋白酶體抑制劑cocktail，1×苯甲基磺酰氟 (Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)，pH 7.4)，吹打重懸后，置于超聲破碎儀中破碎 (功率30%，超聲2 s，間歇4 s，超聲10 min)。超聲后蛋白溶液于4 ℃、13 300 r/min離心 10 min。收集上清用0.45 μm的濾器過濾，置于冰上備用。

1.2.3 融合蛋白GST-UBD的純化及固定化耦聯(lián)

表達GST-UBD融合蛋白的BL21 (DE3) 工程菌株由本實驗室構(gòu)建和保存，在此基礎(chǔ)上進行融合蛋白GST-UBD的誘導、純化及固定化耦聯(lián)。

1.2.4 融合蛋白GST-UBD的誘導

將凍存于–80 ℃的菌種劃線接種于氨芐青霉素 (100 μg/mL) 抗性的選擇平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h獲得單菌落。挑取單菌落接種于 5 mL液體LB培養(yǎng)基 (100 μg/mL) 的氨芐青霉素)，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)菌液1%接種到3 800 mL液體搖瓶中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)3 h (此時菌體600約為 0.6)。添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h。4 500×離心10 min收集菌體，收集的菌體用PBS重懸洗滌1次，6 000×離心10 min收集菌體。用適量PBS重懸菌體 (至菌體600約為40 mL)，低溫超聲 (超聲工作2 s，間歇4 s，180 W，超聲20 min) 破碎細胞。超聲完成后，4 ℃、8 000×離心20 min，收集上清，用于目的蛋白的純化。

1.2.5 融合蛋白GST-UBD的純化

使用AKTA Purifier 100進行蛋白的純化，純化介質(zhì)為5 mL預裝GST-resin柱。將GST-resin柱裝到合適的柱位，10個柱體積的20%乙醇清洗系統(tǒng)后再以20個柱體積的ddH2O清洗系統(tǒng)；用PBS對系統(tǒng)進行平衡，至UV值不變，調(diào)零。2 mL/min上樣，至上樣完全。上樣結(jié)束后，用PBS進行洗滌，至UV值不變。用含有50 mmol/L還原型谷胱甘肽的PBS進行目的蛋白的洗脫，并收集有吸光值處的流分，即為所純化蛋白質(zhì)溶液。

1.2.6 融合蛋白GST-UBD的固定化耦聯(lián)

使用超濾管 (分子截留量為30 kDa) 對純化所得的蛋白溶液進行耦聯(lián)緩沖液(0.2 mol/L NaHCO3，0.5 mol/L NaCl，pH 8.3) 的置換和蛋白濃縮，每次10 000×、3 min，共5次。15個柱體積的4 ℃預冷的1 mmol/L HCl洗滌平衡瓊脂糖珠。將濃縮后的融合蛋白與平衡好的瓊脂糖珠進行混合，于4 ℃翻轉(zhuǎn)孵育24 h。耦聯(lián)結(jié)束后，將混合物于4 ℃、200×離心3 min，棄上清液，加入2倍柱體積0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.5)，于4 ℃翻轉(zhuǎn)孵育4 h。用2倍柱體積30%甘油的PBS洗滌，4 ℃、200×離心3 min，棄上清，共3次。洗滌完畢凍存于–20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 蛋白質(zhì)組樣本制備

樣本制備參考Zhai等[25]的方法進行。取 10 μL蛋白溶液，加入等體積2×SDS上樣緩沖液，均勻混合后，使用10%的SDS-PAGE膠進行電泳。待溴酚藍指示劑距離分離膠與濃縮膠交界面約1 cm處時停止電泳。凝膠經(jīng)考馬斯亮藍G250染色、脫色后，將膠條均分成1 mm3的膠粒，然后進行脫色、干燥步驟。所得膠粒使用Trypsin進行酶解16 h后，抽提肽段，蒸干后于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 LC-MS/MS分析

使用LTQ QrbitrapVelos質(zhì)譜儀 (Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA) 與超高壓液相色譜系統(tǒng)(Waters Corporation，Milford，MA，USA) 聯(lián)用對肽段樣品進行檢測。使用自制的反相色譜柱 (75 μm I.D.×15 cm，3 μm，200A) 進行梯度洗脫。樣品經(jīng)自動進樣器加載于色譜柱上，通過100 min的液相梯度進行分離，其中流動相A為0.1%甲酸 (Formic acid，F(xiàn)A)，2%乙腈 (Acetonitrile，AcN)，98% H2O，流動相B為0.1% FA，90% AcN，10% H2O；流速為 300 nL/min。洗脫后的肽段經(jīng)高精度的LTQ-OribitrapVelos質(zhì)譜儀進行分析，噴霧電壓2 kV，掃描范圍為300–1 600/；自動增益1×106，最大離子注入時間為150 ms，一級譜精度30 000。質(zhì)譜采用一級譜數(shù)據(jù)依賴的二級譜掃描模式 (Data Dependent MS/MS Scan) 碰撞誘導裂解 (CID) 模式碎裂一級離子。選擇20個信號最強的母離子肽段進行碎裂，35%歸一化碰撞能量，動態(tài)排除設(shè)置為30 s。

1.2.9 質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫鑒定

質(zhì)譜產(chǎn)生的譜圖使用MaxQuant (version 1.5.3.30) 軟件進行數(shù)據(jù)搜索，人蛋白質(zhì)序列庫下載自UniProt (http://www.uniprot.org/，release2015.11)。使用Target-Decoy策略進行搜庫，控制肽段和蛋白水平FDR<1%。搜庫參數(shù)設(shè)置為：允許最大2個漏切位點，允許半酶切，每個肽段允許長度為6?20個氨基酸；母離子質(zhì)量誤差 20 ppm，子離子質(zhì)量誤差0.1 Da；固定修飾為半胱氨酸烷基化修飾 (C+57.021 5 Da)，可變修飾為甲硫氨酸氧化修飾 (M+15.994 9 Da) 和GlyGly (K+114.042 9 Da)。

1.2.10 生物信息學分析

使用信號網(wǎng)絡(luò)分析軟件 (Ingenuity pathway analysis，IPA) 進行疾病與功能的生物信息學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合蛋白GST-UBD純化結(jié)果

采用親和層析和凝膠過濾層析相結(jié)合的兩步純化方法對目的蛋白進行純化。圖1A為親和層析時280 nm處吸光值的檢測曲線，可以看出有明顯的洗脫峰出現(xiàn)。對過程中的各階段留樣進行的SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖1B所示，可見50?60 kDa分子量之間有明顯的蛋白條帶，與理論分子量大小 (54.2 kDa) 一致，判斷為目的蛋白。為了除去目的條帶之外的雜帶，進行凝膠過濾層析實驗，檢測曲線如圖1C所示，可以看出有不同的洗脫峰。對不同的組分進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖1D所示，與凝膠過濾前的洗脫組分相比，第5、6、7洗脫組分的雜帶有所減少，而之后組分中的雜蛋白又開始增加，因此取5、6、7洗脫組分進行濃縮、置換和固定化耦聯(lián)。

2.2 融合蛋白GST-UBD固定化耦聯(lián)beads的承載能力檢測結(jié)果

首先利用正常小鼠Balb/c品系的肝臟組織，進行融合蛋白GST-UBD固定化耦聯(lián)beads的承載能力的測試實驗。提取出的全蛋白溶液通過灰度值方法進行定量[21]，結(jié)果顯示，鼠肝全蛋白溶液濃度為4.5 μg/μL (圖2A)。將全蛋白裂解溶液 (Total cell lysate，TCL) 設(shè)置為6個梯度，分別是20、50、100、200、800、1 500 μL，分別與20 μL GST-UBD固定化耦聯(lián)beads在4 ℃條件下進行旋轉(zhuǎn)孵育2 h，純化的UBC蛋白通過銀染方法進行檢測。結(jié)果顯示，TCL梯度 200 μL前富集到的UBC蛋白量逐漸增加，而梯度200 μL后的TCL中富集到的UBC蛋白量基本持平 (圖2B)。利用灰度值定量的方法對銀染結(jié)果進行定量，后對20 μL GST-UBD固定化耦聯(lián)beads可結(jié)合的UBC蛋白的得量作圖 (圖2C)，發(fā)現(xiàn)在200 μL的TCL附近出現(xiàn)拐點。計算可得純化并偶聯(lián)所得的UBDs-beads，每20 μL最大可與900 μg全蛋白進行反應(yīng)，結(jié)果表明UBDs-beads的UBC結(jié)合能力強。以該beads與TCL結(jié)合比例進行后續(xù)的肝癌細胞系Hep3B中的泛素化蛋白富集實驗。

圖1 融合蛋白GST-UBD純化結(jié)果

圖2 融合蛋白GST-UBD固定化耦聯(lián)beads的承載能力檢測結(jié)果

2.3 肝癌Hep3B細胞系泛素化富集實驗結(jié)果

Hep3B細胞系是Aden等從一名8歲的美國男性黑人肝癌患者的活體標本分離出來的肝癌細胞系，具有合成多種人血漿蛋白的能力，是研究原發(fā)性肝癌的重要的細胞系模型。故我們選取Hep3B細胞系作為實驗材料，研究細胞內(nèi)泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)的失調(diào)情況，探索腫瘤細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)的調(diào)控機制。

泛素化富集實驗流程如圖3A所示。我們收集了4×107的Hep3B細胞進行泛素化富集實驗 (圖3B)。提取細胞總蛋白并進行SDS-PAGE分離，結(jié)果如圖3C所示，細胞破碎裂解充分，無降解等情況發(fā)生。同樣根據(jù)灰度值定量算法，Hep3B細胞系的全蛋白裂解液濃度為1.2 μg/μL (圖3C)，根據(jù)計算，我們共投入80 μL的UBDs-beads以保證泛素化蛋白的富集效果。

圖3 肝癌Hep3B細胞系泛素化富集實驗結(jié)果

2.4 Hep3B細胞系UBC蛋白質(zhì)譜檢測結(jié)果

所得全蛋白溶液在4 ℃條件下與UBD-Besds進行結(jié)合，富集細胞內(nèi)的UBC蛋白。為檢測富集效果，富集得到的UBC蛋白進行SDS-PAGE膠分離后，使用銀染的方法進行檢測，結(jié)果如

圖4A所示。所得UBC蛋白條帶與富集前全細胞裂解液 (圖3C) 相比，條帶帶型發(fā)生了明顯的變化，大分子量蛋白增多，富集效果顯著。為進一步確證UBC蛋白的富集效果并檢測富集的UBC蛋白的組成情況，我們使用質(zhì)譜技術(shù)和非標記定量的方法對Hep3B細胞系中富集得到的蛋白進行檢測 (SDS-PAGE上樣膠圖4B)。如圖4C所示，在保留時間25 min左右時，S57肽段集中出峰，且具有較高的峰容量，說明UBC實驗富集效果顯著。

圖4 Hep3B細胞系UBC蛋白質(zhì)譜檢測結(jié)果

2.5 質(zhì)譜搜庫數(shù)據(jù)及生物信息學分析結(jié)果

通過MaxQuant軟件進行搜庫，總鑒定譜圖數(shù)110 196，總鑒定肽段數(shù)26 579，MS2鑒定率24.12%，鑒定到潛在的泛素化蛋白1 900個，鑒定到的泛素化位點158個，分屬于102個蛋白。

我們對1 900個潛在的泛素化蛋白通過IPA軟件進行生物信息學分析。經(jīng)典通路分析結(jié)果顯示，聚類排名前列的通路分別為EIF2信號通路、EIF4和p70S6K信號調(diào)節(jié)通路、蛋白泛素化信號通路、mTOR信號通路、氨酰tRNA合成途徑、上皮細胞緊密連接重塑途徑、生精細胞-支持細胞連接通路和線粒體失調(diào)通路等 (圖5)。這些通路均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，提示腫瘤細胞內(nèi)的泛素化-蛋白酶體的失調(diào)與腫瘤細胞的信號傳導及細胞外基質(zhì)的胞間連接的失調(diào)等具有很高的關(guān)聯(lián)性，從而導致了如細胞凋亡受阻或細胞永生化現(xiàn)象的出現(xiàn)以及腫瘤形態(tài)或癌癥的出現(xiàn)及異常。

3 討論

富集技術(shù)的發(fā)展是翻譯后修飾組學發(fā)展的限速步驟，翻譯后修飾由于存在豐度低、變化快速等問題，從而制約著對其的鑒定和研究。泛素化修飾同樣面臨著這些問題，它在細胞內(nèi)豐度極低且可被26S蛋白酶體降解使其難以被質(zhì)譜鑒定到。本研究中，利用串聯(lián)UBDs的方法對細胞內(nèi)的泛素化蛋白進行無偏向性的富集。我們以肝癌細胞系Hep3B作為實驗材料，對細胞內(nèi)的泛素化蛋白進行富集，并通過LC-MS/MS進行鑒定。我們共鑒定到1 900個潛在的泛素化蛋白和158個泛素化位點，這些被鑒定到的泛素化位點分屬于102個蛋白。對 1 900個潛在的泛素化蛋白進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要聚類于細胞內(nèi)或細胞間信號轉(zhuǎn)導通路、轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的胞間連接以及蛋白泛素化信號通路等，提示腫瘤細胞內(nèi)的泛素化-蛋白酶體的失調(diào)可能與細胞的癌癥特征的出現(xiàn)密切相關(guān)。

圖5 IPA經(jīng)典通路分析結(jié)果

與其他的泛素化富集的方法相比，串聯(lián)UBDs的方法不需要泛素的工程化過表達，使其更適合于哺乳動物細胞或臨床病理組織等樣本的泛素化富集實驗。在本實驗室前期的工作中，我們利用串聯(lián)UBDs的方法，嘗試富集了肝癌細胞系MHCC-97H細胞中的泛素化蛋白[24]。MHCC-97H肝癌細胞系是由中國復旦大學肝癌研究所的研究團隊所建立的具有自發(fā)性轉(zhuǎn)移潛能的高轉(zhuǎn)移性單克隆細胞株人肝癌細胞系[27-28]。比較Hep3B和MHCC-97H的泛素化蛋白，我們發(fā)現(xiàn)MHCC-97H細胞所聚類的信號通路更多的富集于網(wǎng)格蛋白所介導的內(nèi)吞作用的信號通路、RhoGDI通路、Rho家族GTP酶信號通路、14-3-3蛋白介導的通路和肌動蛋白細胞骨架信號通路等。這些通路基本都與細胞骨架的變化或細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移功能密切相關(guān)(圖6)，表明腫瘤細胞內(nèi)泛素化蛋白酶體的失調(diào)與腫瘤本身所表現(xiàn)出來的癌癥特性關(guān)系密切。我們對細胞內(nèi)泛素化蛋白進行高效富集和LC-MS/MS分析，可以準確地表征細胞內(nèi)泛素化蛋白酶體系統(tǒng)失調(diào)的情況，可為腫瘤特征表型蛋白質(zhì)泛素化信號通路研究提供技術(shù)支持[24]。

肝細胞癌是威脅我國國計民生發(fā)展的重大疾病之一。當前，肝癌的臨床診療方法所面臨的主要的困難是肝癌的易轉(zhuǎn)移、易復發(fā)的難題。作為高異質(zhì)性的癌癥，肝細胞癌本身復雜性極高，其本身的復雜性和長病程等特點給我們的研究工作帶來諸多困難。如前文所述，肝癌的癌細胞特征如抗凋亡、特別是侵襲與轉(zhuǎn)移等特征可能與細胞內(nèi)泛素化蛋白酶體系統(tǒng)的失調(diào)有緊密的聯(lián)系，而本文也提供了一種可以應(yīng)用于哺乳動物細胞，特別是腫瘤細胞的泛素化富集的策略，為研究肝細胞癌在發(fā)生發(fā)展的病程變化過程中的細胞內(nèi)泛素化蛋白酶體的連續(xù)變化過程提供了技術(shù)支撐。接下來對于肝細胞癌在發(fā)生發(fā)展病程中泛素化蛋白酶體失調(diào)規(guī)律的深入探討，是揭示肝癌發(fā)生發(fā)展過程分子機制的熱點方向。

圖6 MHCC-97H細胞系UBC蛋白IPA經(jīng)典通路分析結(jié)果[24]

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(本文責編 陳宏宇)

Ubiquitinated proteomics research of Hep3B

Yingzi Qi, Chen Deng, Na Su, Lingqiang Zhang, and Ping Xu

Beijing Institute of Radiation Medicine, State Key Laboratory of Proteomics, National Center for Protein Sciences Beijing, Beijing Proteome Research Center, National Engineering Research Center for Protein Drugs, Beijing 102206, China

Ubiquitination is one of the most major post-translational modifications playing important role in regulation of intra-cellular proteins’ stability, degradation, localization and biological activity. However, these proteins are difficult to be detected due to their low abundance, short half-life. In this study, ubiquitin-binding domains (UBDs) were constructed to purify the ubiquitinated proteins from Hep3B cells. Ubiquitinated proteins and sites were detected by LC-MS/MS. A total of 1 900 potential ubiquitinated proteins were identified. Among them, 158 ubiquitinated sites were identified, belonging to 102 proteins. Bioinformatics analysis revealed that the enriched pathways of ubiquitinated proteins were closely related to tumor occurrence and development. The dysfunction of ubiquitin-proteasome has a high correlation with cell signaling and extracellular matrix changing in tumor cells.

Hep3B, proteomics, ubiquitination, ThUBDs

April 8, 2016; Accepted: May 26, 2016

s: Lingqiang Zhang. Tel: +86-10-68177417; Fax: +86-10-68177417; E-mail: zhanglq@nic.bmi.ac.cn

Ping Xu. Tel: +86-10-61777113; Fax: +86-10-61777050; E-mail: xuping@mail.ncpsb.org

時間：2016-08-05

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160805.1009.001.html

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. 2011CB910600, 2013CB911200), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. SS2012AA020502, 2011AA02A114), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31070673, 31170780), Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program (No. 2012BAF14B00).

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃) (Nos. 2011CB910600，2013CB911200)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃) (Nos. SS2012AA020502，2011AA02A114)，國家自然科學基金 (Nos. 31070673，31170780)，國家科技支撐計劃 (No. 2012BAF14B00) 資助。