鼠李糖乳桿菌的篩選與誘變

乳酸菌培養(yǎng)物中含有乳酸菌、多種代謝產(chǎn)物及變性培養(yǎng)基成分，可以作為一種有益的飼料添加劑。本試驗(yàn)的目的就是要選育出一株抑菌活性高而廣，產(chǎn)酸性能強(qiáng)和生長(zhǎng)繁殖速度快且穩(wěn)定性好的乳酸菌菌種，以利于今后飼用微生態(tài)制劑的開發(fā)與應(yīng)用。現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

材料與方法

菌種

乳酸菌

嗜酸乳桿菌700株、糞鏈球菌48株，由本校微生物室保存；短乳桿菌（17）、嗜酸乳桿菌、糞鏈球菌（130）、胚乳桿菌（557）、德氏乳桿菌保加利亞亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種（1690），購于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

指示菌

金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌（K88）、雞白痢沙門氏菌、蠟狀芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、無乳鏈球菌，購于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)測(cè)所。

乳酸菌的篩選

乳酸菌的分離與鑒定

用MRS和Elliker瓊脂培養(yǎng)基分離鑒定。

乳酸菌的第一步篩選

用牛津杯雙層平板定量擴(kuò)散法（參照何寧等（1999）介紹的方法，略加改進(jìn)）篩選抑菌譜廣、抑菌圈直徑大的乳酸菌菌種（株）。

乳酸菌的第二步篩選

將產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的乳酸菌接種在MRS液體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后，用酸度計(jì)測(cè)定乳酸菌培養(yǎng)物的酸堿度。

乳酸菌的第三步篩選

測(cè)抑菌物質(zhì)重量。

乳酸菌紫外線誘變與篩選

參考諸葛健等 介紹的方法，稍做改進(jìn)。以乳酸菌的抑菌活性、產(chǎn)酸能力和穩(wěn)定性為檢測(cè)項(xiàng)目篩選正向突變菌株。

結(jié)果與分析

乳酸菌分離鑒定

根據(jù)分離菌的形態(tài)、染色及生化特性，可以初步鑒定為：L1、L2是植物乳桿菌；L3是鼠李糖乳桿菌；L4是短乳桿菌；L5是詹氏乳桿菌。

乳酸菌的篩選

將9種13株乳酸菌于4℃冰箱中保存三個(gè)月后活化，僅有五種菌活化成功，對(duì)其進(jìn)行了抑菌活性、產(chǎn)酸能力及生長(zhǎng)速度的測(cè)定。

鼠李糖乳桿菌L3株和胚乳桿菌（557）均有較強(qiáng)的抑菌活性和產(chǎn)酸能力，但前者生長(zhǎng)繁殖速度快，菌體干重是胚乳桿菌的1.83倍，故認(rèn)為鼠李糖乳桿菌L3株是理想的目的菌。

鼠李糖乳桿菌L3株的誘變與篩選

誘變致死率

用紫外線照射鼠李糖乳桿菌L3株37℃、48h的培養(yǎng)物，不同照射時(shí)間對(duì)其致死率結(jié)果不同。

誘變后篩選結(jié)果

用紫外線照射鼠李糖乳桿菌L3株15s后，選取100個(gè)MRS平板上的菌落進(jìn)行培養(yǎng)液抑菌活性和pH值測(cè)定。其中正向突變的10株鼠李糖乳桿菌的抑菌圈直徑和pH值變化結(jié)果。

誘變菌株的抑菌圈直徑增加值變化較大，以L3-22株為最高，L3-50次之；而pH值下降不明顯，均不超過1%。

誘變菌株的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

將10株鼠李糖乳桿菌誘變株連續(xù)傳6代，測(cè)定培養(yǎng)液的抑菌圈直徑和pH值，運(yùn)用EXCEL軟件統(tǒng)計(jì)其變異系數(shù)。鼠李糖乳桿菌L3-22株抑菌圈直徑變異系數(shù)小，故該菌株的穩(wěn)定性較高。

討論

乳酸菌的分離

用MRS 和Elliker瓊脂培養(yǎng)基及厭氧培養(yǎng)方法，從樣品中分離出4種5株乳酸菌，根據(jù)分離菌的形態(tài)、染色及生化反應(yīng)特性，初步鑒定的結(jié)果是：L1、L2為植物乳桿菌；L3為鼠李糖乳桿菌；L4為短乳桿菌；L5為詹氏乳桿菌。用于分離培養(yǎng)的樣品較多，但分離出的乳酸菌較少，可能與乳酸菌初代分離培養(yǎng)較困難以及嚴(yán)氧條件要求較高有關(guān)。

乳酸菌的篩選

本試驗(yàn)對(duì)9種13株乳酸菌進(jìn)行了抑菌活性、抑菌范圍、產(chǎn)酸能力及生長(zhǎng)繁殖速度的測(cè)定，從中篩選出鼠李糖乳桿菌L3株為理想的目的菌，其對(duì)四種革蘭氏陽性菌和兩種革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抑菌作用。乳酸菌素是乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的—種多肽類物質(zhì)，屬于細(xì)菌素，一般對(duì)近緣的革蘭氏陽性細(xì)菌有抑制作用［4，5］。本試驗(yàn)篩選出的鼠李糖乳桿菌L3株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)（主要是乳酸菌素）對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較強(qiáng)的抑菌活性，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其作用機(jī)理和抗菌譜尚有待于進(jìn)一步研究。

乳酸菌在生長(zhǎng)繁殖過程中，可分泌以乳酸為主的酸性物質(zhì)到周圍環(huán)境。鼠李糖乳桿菌L3株具有很強(qiáng)的產(chǎn)酸性能，可使培養(yǎng)基的酸度下降到pH值3.5以下。

乳酸菌的誘變

用紫外線照射鼠李糖乳桿菌L3株進(jìn)行誘變，獲得10株正向突變菌株，考慮到突變菌株的抑菌活性的穩(wěn)定性是主要因素，故將抑菌活性分別提高11.74%和8.92%的兩株突變菌作為目的菌。誘變菌株培養(yǎng)物的pH值下降不明顯，可能與出發(fā)菌株的產(chǎn)酸能力已經(jīng)很高有關(guān)。

經(jīng)過乳酸菌的分離鑒定、篩選、誘變和篩選的過程，從而選育出一株抑菌活性高、抑菌活性穩(wěn)定、抑菌范圍廣、產(chǎn)酸能力強(qiáng)及生長(zhǎng)速度快的鼠李糖乳桿菌，即鼠李糖乳桿菌L3-22株。

引理2 對(duì)任何EB估計(jì)δn=δn（R1，R2，…，Rn）的風(fēng)險(xiǎn)函數(shù)Rn（δn）有

其中E*表示對(duì)（r1，r2，…，rn）的聯(lián)合分布求期望。

定理2 在平方損失函數(shù)下，有替換定數(shù)截尾試驗(yàn)指數(shù)分布的參數(shù)λ，如果先驗(yàn)分布取Gamma 分布，參數(shù)λ的估計(jì)量是漸進(jìn)最優(yōu)EB估計(jì)。其中

證明：由引理2及控制收斂定理知如果

由漸進(jìn)最優(yōu)性的定義可得估計(jì)量δn是漸進(jìn)最優(yōu)EB估計(jì)。因此由控制收斂定理只需證明且即可。

10.3969/j.issn.1001- 8972.2016.21.014