李思寧，唐善虎*，王 柳，趙 亮，趙燕英（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

四川區(qū)域自然發(fā)酵香腸及人工接種牦牛肉發(fā)酵香腸中生物胺含量的研究

李思寧，唐善虎*，王 柳，趙 亮，趙燕英
（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

以四川省10 區(qū)域自然發(fā)酵香腸及人工接種發(fā)酵劑的牦牛肉香腸共21 個樣品為研究對象，測定發(fā)酵香腸中的生物胺含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21個發(fā)酵香腸樣品中均檢測到酪胺、亞精胺、精胺、尸胺、腐胺、色胺及組胺，β-苯乙胺均未檢出；生物胺總量在57.34～411.12 mg/kg，除采自涼山州西昌的自然發(fā)酵牦牛肉香腸和廣安的自然發(fā)酵豬肉香腸中酪胺含量超過了美國食品及藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定標準（酪胺含量≤100 mg/kg），其余均不存在生物胺安全問題。

生物胺；發(fā)酵香腸；牦牛肉；高效液相色譜法

李思寧, 唐善虎, 王柳, 等. 四川區(qū)域自然發(fā)酵香腸及人工接種牦牛肉發(fā)酵香腸中生物胺含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 197-201. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611034. http://www.spkx.net.cn

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611034. http://www.spkx.net.cn

生物胺（biogenic amine，BA）是一類具有生物活性的低分子含氮化合物的統(tǒng)稱[1]，廣泛存在于食品中，特別是腐敗食品和發(fā)酵食品中含量較高，是強致癌物亞硝胺的前體。少量的生物胺對人體具有重要的生理作用，但是攝取過量后會引起不良反應(yīng)，如嘔吐、頭暈、心悸、呼吸困難和高血壓等[2-3]。當(dāng)食品中的生物胺積累到一定濃度時具有潛在的毒性作用，產(chǎn)生食品安全隱患[4]。

香腸是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的代表，因其營養(yǎng)價值高、口味獨特、食用方便而深受消費者的喜愛。香腸在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生生物胺，主要是原料肉中的內(nèi)源酶和外來接種或污染的微生物由其產(chǎn)生的脫羧酶的作用，使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生生物胺的前體物質(zhì)氨基酸，進而轉(zhuǎn)化成生物胺。香腸中最普遍的生物胺是尸胺、腐胺和酪胺。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有一些關(guān)于不同發(fā)酵劑、添加劑及發(fā)酵條件對發(fā)酵香腸生物胺含量影響的研究。Latorre-Moratalla等[5]研究發(fā)現(xiàn)，將清酒乳桿菌接種于希臘aeros thasou香腸中，總腐胺減少，酪胺和組胺也分別減少62%和71%。楊秀娟等[6]研究發(fā)現(xiàn)，采用植物乳桿菌與戊糖片球菌按比例1∶1制備的發(fā)酵劑可以降低香腸中生物胺的含量，而且復(fù)合菌種比單一菌種抑制生物胺生成的效果更好。朱志遠等[7]研究發(fā)現(xiàn)，香腸乳桿菌和肉糖葡萄球菌混合微生物發(fā)酵劑的添加可以有效抑制香腸中色胺、腐胺、尸胺、組胺的生成，而腸膜明串珠菌和肉糖葡萄球菌的混合微生物發(fā)酵劑的添加可以降低β-苯乙胺和酪胺的含量。Komprda等[8]研究了發(fā)酵劑、調(diào)料、貯藏時間和溫度對干發(fā)酵香腸生物胺含量的影響，發(fā)現(xiàn)在室溫下貯藏到達保質(zhì)期一半時間時，生物胺含量為425 mg/kg，到達保質(zhì)期時其含量達到1 029 mg/kg，結(jié)果表明，發(fā)酵香腸的貯藏條件對生物胺含量造成很大影響。Lorenzo等[9]研究了在生產(chǎn)過程中使用葡萄糖、亞硝酸鈉、硝酸鈉、抗壞血酸和檸檬酸鈉5種添加劑對西班牙北部傳統(tǒng)干腌成熟的肉制品中生物胺含量的影響，結(jié)果表明色胺和尸胺是生產(chǎn)結(jié)束后含量最豐富的生物胺，使用添加劑顯著增加了總胺含量以及色胺、酪胺、組胺的含量。

目前關(guān)于添加植物乳桿菌、戊糖片球菌菌株及不同發(fā)酵溫度、葡萄糖添加量對牦牛肉和四川區(qū)域自然發(fā)酵香腸中生物胺含量的研究還未見報道。本實驗以四川10 區(qū)域自然發(fā)酵香腸和自制的不同發(fā)酵時間、菌種配比和葡萄糖添加量的牦牛肉發(fā)酵香腸為研究對象，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、丹磺酰氯柱前衍生方法測定其生物胺含量，為客觀評價香腸的食用安全性及發(fā)酵香腸的開發(fā)和生產(chǎn)提供理論依據(jù)和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

牦牛肉，購于阿壩紅原縣四川紅原牦牛肉食品有限責(zé)任公司，實驗前于－18 ℃冰箱中貯藏7 個月。自然發(fā)酵香腸，由專人專程采樣，于9月份到四川省成都武侯區(qū)、涼山州西昌、眉山、阿壩州紅原、綿陽、崇州、廣安、達州、成都金牛區(qū)、南充選取具有代表性的家庭制作的自然發(fā)酵香腸，用潔凈的自封袋密封帶回實驗室，在24 h內(nèi)處理樣品進行測定，編號為1～10。

自然發(fā)酵香腸制作工藝流程[10]為：原料肉→預(yù)處理→絞碎→添加配料→混合→腌制（4 ℃、4 h）→灌腸→自然晾曬（溫度8～15 ℃、相對濕度75～90%）→產(chǎn)品。

植物乳桿菌（L. plantarum）、戊糖片球菌（P. pentosaceus） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

β-苯乙胺、組胺鹽酸鹽、腐胺標準品（純度99%）美國Sigma公司；酪胺鹽酸鹽（純度99%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；色胺、尸胺、精胺、亞精胺、1,7-二氨基庚烷標準品（純度98%） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；丹磺酰氯標準品 比利時Acros Organics公司；甲醇、丙酮、正己烷（均為色譜純）、乙醚、正丁醇、三氯甲烷、谷氨酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、鹽酸、三氯乙酸（均為分析純） 成都市萇征化玻有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜儀（配自動進樣器和紫外檢測器） 美國Agilent公司；Centrifuge 5804型離心機 德國Eppendorf公司；YGC-12型氮吹儀 成都雅源科技有限公司；FE20型pH計 瑞士Mettler Toledo公司；HH-6型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；HZS-H型水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；絞肉灌腸一體機 永康市卓越塑膠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛肉發(fā)酵香腸制作

選用不同發(fā)酵時間、菌種濃度配比（植物乳桿菌/戊糖片球菌，總菌濃107CFU/g）及葡萄糖添加量，采用二次飽和D試驗設(shè)計確定最佳發(fā)酵時間、菌種濃度配比和葡萄糖添加量。測定前置于4 ℃冰箱中冷藏50 d，取樣后24 h內(nèi)處理樣品進行測定，編號為11～21。

牦牛肉發(fā)酵香腸制作工藝流程為：原料肉→切塊→混勻（瘦肥比為8∶2）→腌制（4 ℃、24 h）→絞肉→接種→灌腸→結(jié)扎、排氣→發(fā)酵（32 ℃、48 h）→終止發(fā)酵（60 ℃、5 h）→產(chǎn)品。

21個發(fā)酵香腸樣品信息見表1。

表1 發(fā)酵香腸樣品信息Table 1 Information of fermented sausage samples

1.3.2 生物胺含量測定

生物胺含量參照GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測定》中HPLC法進行測定。

1.3.2.1 生物胺混合標準溶液的配制

準確稱取組胺鹽酸鹽11.87 mg、酪胺鹽酸鹽12.7 mg、其余6 種生物胺標準品各10 mg，用0.1 mol/L鹽酸定容至10 mL，并分別稀釋制成終質(zhì)量濃度為1.00、2.50、5.00、10.00、15.00、25.00 mg/L的混合標準溶液。

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動相：A為甲醇、B為超純水，梯度洗脫：0～30 min（55%～100% A），30～35 min（100% A），35～36 min（100%～55% A），36～45 min（55% A）；紫外檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；流速：1.5 mL/min。

1.3.2.3 生物胺標準品的衍生

分別吸取不同質(zhì)量濃度的生物胺標準混合溶液0.5 mL于10 mL具塞試管，加入20 μL 100 mg/L的1,7-二氨基庚烷內(nèi)標使用液、1.5 mL飽和碳酸氫鈉、1 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯（用丙酮配制），混勻后在60 ℃水浴中反應(yīng)30 min，每隔10 min快速振蕩一次。取出后加入0.1 mL 50 mg/mL的谷氨酸鈉（用飽和碳酸氫鈉配制）溶液，混勻，60 ℃水浴中保溫15 min，中間振蕩一次。加入1 mL超純水，40 ℃條件下氮氣吹去丙酮，再加入3 mL乙醚，振蕩分層后吸取有機相，重復(fù)萃取兩次，40 ℃氮氣吹干。加入1 mL甲醇溶解殘留物，0.22 μm濾膜過濾，進行HPLC測定。

1.3.2.4 樣品提取

稱取絞碎后的香腸樣品10.00 g放入盛有20 mL質(zhì)量分數(shù)5%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液的錐形瓶中，加入2 mL 100 mg/L的1,7-二氨基庚烷內(nèi)標使用液，混勻后水浴振蕩60 min，離心（3 600 r/min，10 min），取上清液，重復(fù)兩次，用5% TCA定容至50 mL，過濾。吸取10 mL過濾后的提取液于具塞試管中，加入10 mL正己烷，水浴振蕩5 min，棄去上層有機相，收集下層溶液，重復(fù)兩次，以除去提取液中的脂肪。在除去脂肪的溶液中加入適量NaCl使溶液飽和。吸取飽和的樣品提取液5 mL置于50 mL離心管中，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至12。加入5 mL正丁醇-三氯甲烷（1∶1，V/V），水浴振蕩5 min，離心（3 600 r/min，10 min），吸取下層有機相，再重復(fù)萃取兩次。吸取3 mL萃取液于10 mL具塞試管，加入0.2 mL 1 mol/L的鹽酸，40 ℃氮氣吹干，再用1 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶解殘留物，待衍生。

1.3.2.5 樣品衍生

吸取待衍生的樣品溶液0.5 mL于10 mL具塞試管，加入1.5 mL飽和碳酸氫鈉、1 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯，其余操作同1.3.2.3節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺及生物胺總含量為指標，用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，每個處理重復(fù)3 次，所有實驗結(jié)果采用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線回歸方程

以標準品峰面積比為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到8種生物胺標準品回歸方程及相關(guān)系數(shù)（表2）。8種生物胺的峰面積比與其相應(yīng)質(zhì)量濃度均成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。通過該方法可準確測出樣品中生物胺的含量。

表2 測定生物胺的標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Standard curve equations with correlation coeffi cients for biogenic amiinneess

2.2 標準品色譜圖

圖1 8 種生物胺標準品色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of 8 biogenic amine standards

由圖1可知，1～8號標準品出峰時間依次為10.935、13.163、14.480、15.860、19.928、25.330、26.189、28.855 min，30 min內(nèi)8 種生物胺得到了有效分離，且峰形對稱、無基線漂移和拖尾現(xiàn)象，各生物胺分離效果較理想。

2.3 發(fā)酵香腸中生物胺含量

21 種發(fā)酵香腸樣品經(jīng)HPLC測定，求平均值，并根據(jù)標準曲線，得到8 種生物胺含量及生物胺總量，結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵香腸中生物胺含量Table 3 Biogenic amine contents in fermented sausages mg/kg

2.3.1 生物胺總量

由表3可知，不同區(qū)域自然發(fā)酵香腸中生物胺含量差異較大，生物胺總量在57.34～411.12 mg/kg，以8號樣品（達州）中生物胺總量最低，2號樣品（涼山州西昌）最高。自然發(fā)酵香腸中均未檢出β-苯乙胺，除2號樣品外，其余樣品均未檢出組胺。

自制牦牛肉發(fā)酵香腸中生物胺含量因發(fā)酵條件不同存在較大差異，生物胺總量在139.71～303.19 mg/kg，17號樣品（發(fā)酵時間38 h、植物乳桿菌∶戊糖片球菌= 1.2∶1、葡萄糖添加量0.20%）中生物胺總量最低，11號樣品（發(fā)酵時間48 h、植物乳桿菌∶戊糖片球菌=0∶0、葡萄糖添加量0.44%）最高。自制牦牛肉發(fā)酵香腸中均未檢出β-苯乙胺和組胺。

生物胺中組胺毒性最強，酪胺次之[11]。美國食品及藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定食品中生物胺總量≤1 000 mg/kg、組胺含量≤50 mg/kg、酪胺含量≤100 mg/kg。檢測的21 個發(fā)酵香腸樣品中生物胺總量均未超過限量，但2號樣品和7號樣品中酪胺超標，存在食品安全問題。

2.3.2 色胺含量

21 個樣品中色胺檢出率為61.90%，檢出限0～39.01 mg/kg。色胺是由色氨酸脫羧形成的胺，是香腸中含量較低的胺，一般低于30 mg/kg[12-13]。所測21 個發(fā)酵香腸樣品，除11號和12號牦牛肉發(fā)酵香腸外，其余色胺含量都低于30 mg/kg。

2.3.3 β-苯乙胺含量

所測21個香腸樣品，β-苯乙胺檢出率0，檢出限0。β-苯乙胺是自然化合物，是由苯丙氨酸脫羧形成，在體內(nèi)很快被酵素單胺氧化酶代謝。Joosten等[14]認為β-苯乙胺的形成主要與香腸中存在高濃度的酪胺有關(guān)。文獻[15]報道，β-苯乙胺和酪胺同時產(chǎn)生，這與本實驗研究結(jié)論不一致，可能是實驗所測樣品中的β-苯乙胺被酵素單胺氧化酶代謝后分解生成了其他物質(zhì)，也可能與四川區(qū)域的微生物菌系有關(guān)，此結(jié)果還沒見報道。具體原因有待進一步研究。

2.3.4 腐胺和尸胺含量

實驗所測21 個香腸樣品，腐胺檢出率71.43%，檢出限0～22.36 mg/kg；尸胺檢出率80.95%，檢出限0～76.57 mg/kg。腐胺和尸胺是發(fā)酵香腸中主要的生物胺，這與文獻[13]報道一致。腐胺是由鳥氨酸脫羧產(chǎn)生，在腐敗物中含量較多；尸胺是賴氨酸脫羧后的產(chǎn)物，而賴氨酸是牦牛肉中含量較高的氨基酸，次于天冬氨酸和谷氨酸，其含量高達1.78～2.01 mg/g蛋白質(zhì)[16]，這是牦牛肉發(fā)酵香腸中尸胺含量較高的原因之一。

腐胺和尸胺對人類健康并無不利影響，但是它們能通過抑制脫毒酶、雙胺氧化酶和羥甲基轉(zhuǎn)換酶的活性而潛在地影響組胺含量，當(dāng)腐胺和尸胺存在時，會加強組胺的毒性[17]。

2.3.5 組胺含量

實驗所測21 個香腸樣品，只有2號自然發(fā)酵香腸中檢出了組胺，組胺檢出率4.76%，檢出限0～23.92 mg/kg。組胺是由組氨酸脫羧而成，是生物胺中毒性最強的，對人體的健康影響也最大。組胺在發(fā)酵香腸中沒有規(guī)定限量，但在魚產(chǎn)品中歐洲規(guī)定的最高限量為100 mg/kg[18]。組胺主要來源于腸桿菌等微生物的污染，2號自然發(fā)酵香腸樣品可能是受到了腸桿菌的污染，檢出了組胺。

2.3.6 酪胺含量

實驗所測21 個香腸樣品，酪胺檢出率95.24%，檢出限0～277.26mg/kg，是發(fā)酵香腸中含量最高的生物胺，本實驗結(jié)果與文獻[19]報道一致。酪胺是酪氨酸脫羧后的產(chǎn)物，對于一些敏感的個體，攝入100 mg的酪胺就會產(chǎn)生中毒癥狀。據(jù)Nout[20]研究，乳酸菌與酪胺的形成有關(guān)，采自涼山州西昌的自然發(fā)酵牦牛肉香腸與廣安的自然發(fā)酵豬肉香腸中酪胺含量高，可能與這兩個區(qū)域的微生物菌系有關(guān)，還可能與加工環(huán)境有關(guān)。

2.3.7 亞精胺、精胺含量

實驗所測21 個香腸樣品，亞精胺和精胺檢出率均100%，檢出限分別為4.52～60.66 mg/kg和15.26～65.26 mg/kg。研究發(fā)現(xiàn)[21]亞精胺和精胺是原料肉中最主要的生物胺，是發(fā)酵香腸中始終存在的生物胺，并且在發(fā)酵后產(chǎn)品中含量波動小。亞精胺和精胺均是由鳥氨酸脫羧產(chǎn)生的腐胺與S-腺苷甲硫氨酸降解產(chǎn)生的丙胺基結(jié)合生成，因此其含量與腐胺有直接關(guān)系。國外研究報道香腸中亞精胺和精胺含量一般＜50 mg/kg，本實驗所測樣品中，除2號自然發(fā)酵香腸精胺含量超過50 mg/kg，12號人工接種牦牛肉發(fā)酵香腸亞精胺含量超過50 mg/kg，其余樣品亞精胺和精胺含量均＜50 mg/kg。

3 討 論

由于香腸的種類和生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)條件不同，所以產(chǎn)生的生物胺的種類和數(shù)量也不同[22-23]。自然發(fā)酵香腸和人工接種牦牛肉發(fā)酵香腸在制作工藝上，最大的區(qū)別在于是否人工接種微生物發(fā)酵劑及發(fā)酵條件。本實驗所測大部分牦牛肉發(fā)酵香腸生物胺總含量、尸胺及酪胺含量比四川10 區(qū)域自然發(fā)酵香腸中的含量高，尤其是尸胺含量，這主要與原料有關(guān)，發(fā)酵香腸中生物胺的濃度和組成受原料肉衛(wèi)生條件的影響[19]，牦牛肉發(fā)酵香腸所采用的原料是冷凍7 個月的牦牛肉，與剛屠宰的牦牛肉相比，其上附著的微生物種類和數(shù)量發(fā)生了變化，新鮮度明顯下降，生物胺含量增加；其次，牦牛肉相較于豬肉，蛋白質(zhì)和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的含量要高，牦牛肉蛋白質(zhì)含量22.5%左右[24]、豬肉為14.6%左右，牦牛肉在貯藏過程中在微生物或酶作用下，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基酸，生物胺前體物氨基酸的含量直接影響著生物胺的含量，這也能解釋2號自然發(fā)酵香腸中生物胺含量高的原因；此外，還與發(fā)酵微生物有關(guān)，2號自然發(fā)酵香腸原料是牦牛肉，其生物胺含量比接種了發(fā)酵劑的牦牛肉發(fā)酵香腸的生物胺含量要高很多，且11號牦牛肉發(fā)酵香腸（發(fā)酵時間48 h、植物乳桿菌∶戊糖片球菌=0∶0、葡萄糖添加量0.44%）生物胺含量比其他接種了發(fā)酵劑的牦牛肉發(fā)酵香腸生物胺含量高，這表明是否添加發(fā)酵劑及發(fā)酵條件也是影響生物胺含量的重要因素。

微生物產(chǎn)生物胺的情況復(fù)雜多變，這不僅與食品上微生物的種屬有關(guān)，還與菌株和環(huán)境條件相關(guān)?？赏ㄟ^采用優(yōu)質(zhì)的新鮮原料肉、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵劑，改變加工、貯藏條件和衛(wèi)生條件來減少食品中生物胺的含量[25]。

4 結(jié) 論

在被檢測的21 個發(fā)酵香腸樣品中，均檢出了酪胺、亞精胺、精胺、尸胺、腐胺、色胺及組胺，β-苯乙胺均未檢出；除了2號（涼山州西昌）樣品檢出了組胺，其余自然發(fā)酵香腸和自制牦牛肉發(fā)酵香腸中均未檢出組胺；亞精胺和精胺是所有樣品中均檢出的生物胺。

四川10區(qū)域自然發(fā)酵香腸和人工接種發(fā)酵劑的牦牛肉發(fā)酵香腸共21 個樣品，生物胺總含量在57.34～411.12 mg/kg范圍內(nèi)，除了來自涼山州西昌的2號自然發(fā)酵牦牛肉香腸和廣安的7號自然發(fā)酵豬肉香腸中酪胺含量超過了FDA規(guī)定標準，其余樣品均在安全攝食范圍內(nèi)。

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Biogenic Amine Contents of Naturally Fermented Sausage and Starter Culture Fermented Yak Meat Sausage in Sichuan Area

LI Sining, TANG Shanhu*, WANG Liu, ZHAO Liang, ZHAO Yanying
(College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

A total of 21 fermented sausage samples, including naturally fermented sausages from 10 different areas of Sichuan province and starter culture fermented yak meat sausages, were investigated for the contents of biogenic amines. The results showed that tyramine, spermidine, spermine, cadaverine, putrescine, tryptamine and histamine were determined in these 21 fermented sausage samples, while β-phenylethylamine was not detected. The total content of biogenic amines in samples was in the range of 57.34–411.12 mg/kg. The contents of tyramine in naturally fermented samples collected from Xichang and Guang’an exceeded the limit (≤ 100 mg/kg) set by the U.S. Food and Drug Administration (FDA), and the total content of biogenic amines in other test samples was within the safety range.

biogenic amine; fermented sausage; yak meat; high performance liquid chromatography (HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201611034

TS251.5

A

2015-10-12

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD29B02）；四川省科技支撐計劃項目（16ZC2530）

李思寧（1988—），女，實驗師，碩士，研究方向為食品加工與貯藏技術(shù)。E-mail：616906108@qq.com

*通信作者：唐善虎（1964—），男，教授，博士，研究方向為動物性食品加工及檢測。E-mail：stang01@126.com