徐 洲，劉 潔，陳 意，范浩軍,*

丁二酰化對(duì)膠原生物活性結(jié)構(gòu)的影響

徐 洲1,2，劉 潔3，陳 意1，范浩軍1,*

（1.四川大學(xué) 皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065；2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；3.齊魯工業(yè)大學(xué)皮革化學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

本實(shí)驗(yàn)以豬皮膠原為研究對(duì)象，通過丁二酸酐改性制備了?；z原，采用儀器分析法對(duì)?；z原三股螺旋結(jié)構(gòu)的保留程度進(jìn)行檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上使用原子力顯微鏡和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)酰化膠原的生物活性進(jìn)行了進(jìn)一步考察。結(jié)果表明：膠原的?；葹?2.4%，酰化膠原的等電點(diǎn)降低到4.1。X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）、熱變性溫度、圓二色譜法檢測(cè)結(jié)果顯示，丁二酸酐改性整體上并未破壞膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)；?；z原在原子力顯微鏡下呈現(xiàn)了膠原特有的纖維結(jié)構(gòu)，成纖細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)?；z原可以兼容成纖細(xì)胞，并在一定程度上促進(jìn)成纖細(xì)胞的增殖，丁二?；粫?huì)破壞膠原的生物活性結(jié)構(gòu)。

膠原；丁二酸酐；生物活性

膠原，亦稱膠原蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，是動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的20%～30%。目前，膠原已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于保健食品、食品添加劑、美容化妝品和生物醫(yī)用材料等多個(gè)領(lǐng)域。在功能性食品方面，由于骨細(xì)胞中的骨膠原是羥基磷灰石的黏合劑，它與羥基磷灰石共同構(gòu)成了骨骼的主體，攝入足夠的膠原蛋白，就能在一定程度上保證人體正常的鈣質(zhì)需要量，因此膠原可用作補(bǔ)鈣食品[1]；在保健食品方面，食用含膠原蛋白豐富的食品，能有效地增加皮膚組織細(xì)胞的儲(chǔ)水能力，增強(qiáng)和維持肌膚良好的彈性，強(qiáng)化肌膚的韌性，延緩機(jī)體的衰老[2]；在食品添加劑方面，膠原蛋白可以影響肉類的嫩度和肉類蒸煮后肌肉的紋理，其含量和存在狀態(tài)與肉制品的嫩度密切相關(guān)[3]，添加一定量的膠原，可以使臘腸的感官、質(zhì)地和口感得到明顯改善[4]，因此可應(yīng)用于肉制品改良劑；此外，將膠原蛋白輔以甘油、氯化鈣等添加劑，制成可食性蛋白膜用于肉類保鮮效果顯著，因而可用作食品保鮮材料[5]。在生物醫(yī)用材料方面，由于膠原是生物大分子，其相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)30萬，具有3 條多肽鏈相互纏繞而成的特殊三股螺旋結(jié)構(gòu)，這賦予了膠原良好的生物相容性、促進(jìn)細(xì)胞增殖等生物特性，從而使吸附材料[6-7]、整形和美容護(hù)膚材料[8]等膠原基材料得以廣泛應(yīng)用成為了可能。

在將膠原用作生物材料、功能性食品原料之前，往往需要通過修飾改性來賦予膠原更多優(yōu)良的性能。膠原分子中含有的大量羥基、羧基、氨基等活性基團(tuán)，使得膠原改性成為了可能。特別指出的是，膠原完整的三股螺旋是膠原應(yīng)用于功能性食品、保健品的載體，是發(fā)揮良好生物相容和組織誘導(dǎo)作用的基礎(chǔ)[9]，如果膠原被生化降解，三股螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞而形成變性產(chǎn)物明膠，其在模擬生理?xiàng)l件下已經(jīng)不能激活細(xì)胞的生長(zhǎng)，基本喪失了生物活性[10]。因此，無論是何種改性方法，要保持膠原的生物活性，都必須以保留膠原自身的三股螺旋結(jié)構(gòu)為前提。

研究表明，在膠原側(cè)鏈上引入親水基團(tuán)羧基，可以使膠原更具吸水性。在保健食品和化妝品上可防止水分散失而具有保濕作用；在吸附材料上，可以增強(qiáng)膠原吸收和結(jié)合金屬離子的能力[11-12]；在生物醫(yī)用材料上，由于膠原分子的負(fù)電荷量大幅度增加，使得改性后的膠原血小板黏附能、血纖維蛋白形成能相對(duì)較弱，呈現(xiàn)一定的抗栓性[13]。基于此理，本實(shí)驗(yàn)擬采用丁二酸酐對(duì)膠原進(jìn)行?；男远媵然ㄟ^圓二色譜法（ircular dichroism，CD）、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）和原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）等表征方法，重點(diǎn)考察?；昂髮?duì)膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)采用成纖細(xì)胞培養(yǎng)評(píng)價(jià)其細(xì)胞相容性，以期為丁二酰化膠原在食品保健、生物活性材料方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬皮塊，由皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

琥珀酸酐、冰醋酸、氫氧化鈉、氯化鈉、二甲基亞砜（分析純） 成都市科龍?jiān)噭S；胃蛋白酶（1∶3 000） 德國Merck-Millipore公司；透析袋（截留分子質(zhì)量8 kD） 美國Solarbio公司；35 24細(xì)胞培養(yǎng)孔板（24、96 孔） 美國Corning公司；DMEM培養(yǎng)基美國Gibcobrl公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康儀器有限公司；NANO ZS型納米粒度及ZETA電位分析儀、ZEN3600型納米粒度及電位分析儀 英國馬爾文公司；DX-1000型X射線衍射儀 中國丹東方圓儀器有限公司；Model400型圓二色譜儀 美國Aviv公司；VP-DSC超靈敏差示掃描量熱儀（ultrasensitive differential scanning calorimetry，US-DSC） 美國通用電氣公司；Model 550型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 純膠原和丁二?；z原的制備

將豬皮剪成小方塊后溶于0.5 mol/L醋酸溶液中，加入皮質(zhì)量3%的胃蛋白酶，磁力攪拌48 h，將膠原溶液在4 ℃條件下9 000 r/min離心10 min后去掉沉淀物質(zhì)，其上清液用NaCl鹽析，離心后將沉淀溶于0.1 mol/L醋酸溶液進(jìn)行透析72 h，隨后將膠原溶液凍干得純膠原（acidpepsin solubilized collagen，APC），改性備用。

將純膠原用0.05 mol/L醋酸配制為50 g/L的膠原懸浮液，在4 ℃條件下緩慢滴加一定量的丁二酸酐溶液，將反應(yīng)體系的pH值保持在9左右，攪拌4 h后于0.1 mol/L醋酸溶液中透析，透析3 d，每8 h換液一次，隨后將膠原凍干得丁二酰化膠原（collagen acylated by succinic anhydride，CAS），表征備用。

1.3.2 酰化膠原修飾程度的測(cè)定

采用三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS）法[14]測(cè)定未改性賴氨酸（ε-氨基）的含量，以確定改性膠原的修飾程度。取11 mg膠原樣品于螺紋管中，加入1 mL 4% NaHCO3溶液，1 mL 0.5% TNBS溶液，40 ℃水浴輕微振蕩3 h，冷卻至室溫。加入3 mL 6 mol/L HCl搖勻封管，于60 ℃的水浴中輕微振蕩2 h充分水解。用5 mL去離子水稀釋后，采用20 mL的無水乙醚溶液分3 次充分萃取水解稀釋液以除去過量的TNBS。靜置分層，用吸管吸去乙醚層，并在熱水浴中加熱20 min以蒸發(fā)掉殘余的乙醚，再加入用15 mL去離子水稀釋，于346 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。酰化度按下式計(jì)算。

式中：Mw為蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量；A為?；z原樣品溶液在346 nm波長(zhǎng)處的吸光度；0.02為?；z原樣品溶液的體積/L；1.46×104為三硝基苯-賴氨酸（trinitrophenol-Lys，TNP-Lys）摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））；b為光程/cm；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 等電點(diǎn)（pI）的測(cè)定

將膠原用0.01 mol/L 乙酸配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，以0.5為梯度分別測(cè)定pH值在2.5～7.5之間膠原溶液的Zeta電位，當(dāng)Zeta電位值為0時(shí)的pH值即為膠原的等電點(diǎn)。

1.3.4 XRD檢測(cè)

采用X射線衍射儀測(cè)定?；z原的圖譜，使用CuKα射線進(jìn)行檢測(cè)，相關(guān)參數(shù)為管電流30 mA，管電壓40 kV，2θ的掃描范圍5°～40°，掃描速率為0.15（°）/s。

1.3.5 CD分析

將純膠原和酰化膠原配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，以9 000 r/min離心20 min后，取上清液加入比色皿中，放入圓二色譜儀中在180～260 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)以氮?dú)庾鳛檩d氣進(jìn)行掃描，掃描速率為20 nm/min，從而得到掃描圖譜。

1.3.6 熱變性溫度測(cè)定

將?；z原配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的膠原溶液，使用US-DSC對(duì)其進(jìn)行分析。膠原樣品溶液和參比溶液（醋酸溶液）在儀器中先脫氣30 min，再以1 ℃/min的速率從25 ℃升溫到55 ℃進(jìn)行樣品檢測(cè)。

1.3.7 AFM觀察

將膠原樣品溶解在0.5 mol/L的醋酸溶液中配成10 μg/mL的膠原溶液，然后將5 μL溶液至新剝離的云母片中，在干燥器中放置2 d干燥成膜。采用原子力顯微鏡在輕敲模式（soft tapping mode）下觀察膠原的表面形貌，掃描速率均為1 Hz，采集的AFM圖像用Nano-scope分析軟件分析處理。

1.3.8 細(xì)胞培養(yǎng)活力比較

參考噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法對(duì)膠原和明膠樣品的細(xì)胞相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)[15]。將環(huán)氧乙烷滅菌后的明膠、?；z原樣品溶解在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，此后將成纖維細(xì)胞按4×104個(gè)/mL 接種于涂覆有明膠或膠原溶液的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，采用DMEM培養(yǎng)基（含有體積分?jǐn)?shù)1%的青霉素和鏈霉素）在37 ℃培養(yǎng)1、3、5、7 d，隔天換液，同時(shí)加入20 μL MTT，在37 ℃條件下培養(yǎng)4 h，以形成藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，去掉上清液，在各孔中加入1.5 mL二甲基亞砜充分溶解甲瓚結(jié)晶，室溫振蕩10 min。隨后在492 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度（OD）值，樣品各取5 個(gè)平行樣，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性膠原?；潭鹊淖兓?/p>

膠原蛋白中的賴氨酸殘基的ε-氨基可與TNBS的磺酸基發(fā)生特異性不可逆取代反應(yīng)，形成TNP復(fù)合物，在346 nm波長(zhǎng)處有特征光吸收，以此可以測(cè)得膠原蛋白中自由氨基的修飾程度。經(jīng)檢測(cè)，丁二酸改性后膠原的?；龋é?氨基轉(zhuǎn)化率）為62.4%，其?；实陀诶碚撚?jì)算值，這可能是由于丁二酸酐在堿性水溶液中會(huì)發(fā)生部分開環(huán)水解副反應(yīng)，生成相應(yīng)的酸，因此一定程度降低了其?；?。

2.2 ?；z原等電點(diǎn)的變化

膠原蛋白是兩性化合物，當(dāng)外界溶液的pH值為膠原蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，膠原表面的雙電層消失，膠原的動(dòng)電Zeta電位為零，膠原的溶解度降到最低，此時(shí)的pH值即為膠原的等電點(diǎn)。由圖1可知，天然膠原的等電點(diǎn)為5.4，而?；男阅z原的等電點(diǎn)為4.1，由此可知丁二酸酐在與膠原側(cè)鏈氨基反應(yīng)過程中引入了羧基，致使丁二酸酐改性后的膠原等電點(diǎn)pH值降低。由等電點(diǎn)的定義可以得出，?；z原的等電點(diǎn)越偏離中性溶液，其在中性溶液中的溶解度將更大，因此?；z原更加利于在中性溶液中進(jìn)行二次溶解和應(yīng)用。

圖1 膠原及?；z原的等電點(diǎn)Fig.1 pI of APC and CAS

2.3 ?；z原三股螺旋結(jié)構(gòu)保留度分析

2.3.1 酰化膠原的XRD檢測(cè)

圖2 ?；z原的XRD圖譜Fig.2 XRD pattern of CAS

膠原X射線圖譜的衍射峰中，在2 θ角為3 1°（0.29 nm波長(zhǎng)）附近會(huì)出現(xiàn)有一個(gè)特征峰值，其反映的是膠原螺旋的一個(gè)旋轉(zhuǎn)高度內(nèi)所對(duì)應(yīng)的軸向周期，即膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)[16]。由于X射線衍射是定量測(cè)定膠原不同結(jié)構(gòu)層次變化[17]，如果膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞，將不會(huì)在31°位置出現(xiàn)特征衍射峰。由圖2可知，?；z原在2θ角為31.96°處出現(xiàn)了特征衍射峰，初步說明丁二酸酐改性沒有破壞膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.3.2 ?；z原的熱穩(wěn)定性分析

膠原的熱變性溫度（Ts）是反映其天然螺旋結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)之一，US-DSC可作為精確的量熱手段用于研究稀溶液中膠原蛋白的構(gòu)象變化。膠原的熱變性溫度區(qū)間為35～40 ℃，在US-DSC圖譜中會(huì)呈現(xiàn)特定的峰值，而膠原的變性產(chǎn)物明膠由于不存在規(guī)整的三股螺旋結(jié)構(gòu)[18]，就不會(huì)在圖譜中出現(xiàn)峰值現(xiàn)象。由圖3可知，超靈敏差示掃描量熱儀能檢測(cè)到膠原及?；z原中蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變而展現(xiàn)出的峰值，純膠原和?；z原的峰值分別為39.6 ℃和38.5 ℃，進(jìn)一步表明?；z原保留了膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖3 膠原、?；z原的US-DSC圖譜Fig.3 US-DSC pictures of APC and CAS

2.3.3 ?；z原的圓二色譜解析

圓二色譜法是測(cè)定膠原特殊三股螺旋結(jié)構(gòu)的有效方法，因?yàn)槟z原是存在特定結(jié)構(gòu)的旋光性生物大分子，具有活性生色基團(tuán)及折疊結(jié)構(gòu)兩方面的典型圓二色性。如果三股螺旋結(jié)構(gòu)沒有被破壞，膠原的圓二色譜特征圖譜將在210～230 nm波長(zhǎng)范圍出現(xiàn)一個(gè)正吸收峰，在190～200 nm波長(zhǎng)范圍呈現(xiàn)一個(gè)負(fù)的吸收峰[19]。同時(shí)，正負(fù)吸收峰的強(qiáng)度比值（the ratio of positive and negative，Rpn）可以反映三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整程度[20-21]。圖4圓二色譜圖顯示，膠原及?；z原在223 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)了正吸收峰，而在197 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)了一個(gè)負(fù)的吸收峰，再次印證了丁二酸酐改性整體上沒有破壞膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)，但?；男阅z原的Rpn值0.138卻小于原膠原的0.142，由此可以看出，由于羧基的引入，使得膠原分子間的化學(xué)鍵有所破壞，因此?；男允沟萌陕菪Y(jié)構(gòu)的整體完整性略有降低。

圖4 膠原及?；z原的圓二色譜圖Fig.4 CD spectra of APC and CAS

2.4 膠原的纖維結(jié)構(gòu)

膠原分子的三股螺旋結(jié)構(gòu)是膠原纖維超分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。膠原溶液中的溶劑被吸收后，已溶解的膠原分子會(huì)通過分子間的相互作用再次自聚成纖維狀的結(jié)構(gòu)。如果單個(gè)原膠原分子的三股螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，那么就不會(huì)產(chǎn)生自聚合作用而呈現(xiàn)纖維狀結(jié)構(gòu)。圖5結(jié)果顯示，純膠原、?；z原以及明膠的纖維形態(tài)呈現(xiàn)出一定的差異，由于明膠的三股螺旋結(jié)構(gòu)已被破壞，通過原子力顯微鏡并不能觀察到纖維結(jié)構(gòu)。但純膠原和?；z原都顯示出膠原分子特殊的纖維結(jié)構(gòu)，由此可以看出丁二酰改性并沒有破壞膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)。但通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，酰化膠原纖維間的間隙變得更大，這可能是由于羧基的引入，增大了膠原分子間的靜電排斥力，從而使膠原纖維間的距離發(fā)生了改變。

圖5 純膠原（a）、酰化膠原（b）、明膠（c）的原子力顯微鏡圖Fig.5 AFM images of APC (a), CAS (b) and gelatin (c)

2.5 酰化膠原的細(xì)胞相容性評(píng)估

膠原完整的三股螺旋構(gòu)象是膠原發(fā)揮良好生物相容和組織誘導(dǎo)作用的基礎(chǔ)[9]，通過觀察成纖維細(xì)胞在涂覆有明膠或膠原溶液的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中的生長(zhǎng)情況，得出結(jié)果如圖6所示，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)段（1、3、5、7 d）的細(xì)胞活力呈現(xiàn)一定的差異。成纖維細(xì)胞培養(yǎng)之后，膠原和?；z原樣品均具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的能力，成纖維細(xì)胞在膠原和?；z原培養(yǎng)基上能激活成纖細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，二者整體呈現(xiàn)細(xì)胞增殖趨勢(shì)，在7 d后相應(yīng)的OD492nm值均在1.5以上。而明膠培養(yǎng)基上的纖維細(xì)胞并未呈現(xiàn)明顯增殖，其光密度值的變化可能是由于明膠的分解物和死亡成纖細(xì)胞的存在造成的，由此可以得知膠原和?；z原均具有一定的細(xì)胞相容性，具備促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的活性。

圖6 成纖維細(xì)胞的活力比較Fig.6 Proliferation of fibroblasts over a period of 7 days

3 結(jié) 論

由膠原?；戎?、等電點(diǎn)圖譜可知，丁二酸酐改性在膠原分子上成功引入了羧基；從XRD衍射圖譜、熱變性溫度測(cè)量、圓二色譜檢測(cè)結(jié)果可以得出，丁二酸酐改性整體上沒有破壞膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)，三股螺旋結(jié)構(gòu)的保留使得膠原在原子力顯微鏡下呈現(xiàn)了膠原特有的纖維結(jié)構(gòu)；通過細(xì)胞培養(yǎng)孔板中涂覆膠原溶液進(jìn)行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)?；z原可以兼容成纖細(xì)胞，并在一定程度上促進(jìn)成纖細(xì)胞的增殖。

在研究方法上，除本研究所采用的檢測(cè)方法外，還可以使用傅里葉紅外光譜法、偏光顯微鏡觀察法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)膠原結(jié)構(gòu)進(jìn)行更進(jìn)一步的分析和生物活性評(píng)估。本研究采用丁二酸酐對(duì)純膠原進(jìn)行修飾改性，引入了親水基團(tuán)羧基，將更加利于?；z原在中性溶液中的二次溶解和應(yīng)用，?；z原在功能性膠原食品、負(fù)載材料、生物醫(yī)用材料的應(yīng)用上具有一定的應(yīng)用潛力。

[1] 萬春燕, 王英華, 鄔元娟, 等. 膠原蛋白在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展前景[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2008(9): 24-26.

[2] LI X, AGRAWAL C M, WANG Xiaodu. Age dependence of in situ termostability of collagen in human bone[J]. Calcified Tissue International, 2003, 72(4): 513-518. DOI:10.1007/s00223-002-1065-y.

[3] SCHILLING M W, MINK L E, GOCHENOUR P S, et al. Utilization of pork collagen for functionality improvement of boneless cured ham manufactured from pale, soft, and exudative pork[J]. Meat Science, 2003, 65(1): 547-553. DOI:10.1016/S0309-1740(02)00247-4.

[4] MEULLENET J F, CHANG H C, CARPENTER J A, et al. Textural properties of chicken Fankfurters with added collagen fibers[J]. Journal of Food Science, 1994, 59(4): 729-733.

[5] 羅愛平, 朱秋勁, 鄭虹, 等. 綜合保鮮技術(shù)對(duì)冷卻牛肉的保質(zhì)研究[J].食品科學(xué), 2004, 25(2): 174-179.

[6] ZENG Y H, LIAO X P, HE Q, et al. Recovery of Th(IV) from aqueous solution by reassembled collagen-tannin fiber adsorbent[J]. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 2011, 280(1): 91-98. DOI:10.1007/s10967-008-7448-z.

[7] LUO Z Y, ZHANG X L, FAN H J. Modification of collagen fiber for high Cr (III) adsorption[J]. Journal of the American Leather Chemists Association, 2009, 104(4): 149-155.

[8] ZHANG Y, LIU W T, LI G Y, et al. Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J]. Food Chemistry, 2007, 103(1): 906-912. DOI:10.1016/j.foodchem.2006.09.053.

[9] LI G Y, FUKUNAGA S, TAKENOUCHI K, et al. Comparative study of the physiological properties of collagen, gelatin and collagen hydrolysate as cosmetic materials[J]. International Journal of Cosmetic Science, 2005, 27(2): 101-106. DOI:10.1111/j.1467-2494.2004.00251.x.

[10] KLAPPER M H, KLOTZ I M. Acylation with dicarboxylic acid anhydrides[J]. Methods in Enzymology, 1972, 25: 531-536. DOI:10.1016/S0076-6879(72)25050-9.

[11] ZHANG L P, ZHU Y J, QIANG X H. Modification of collagen improving high-absorbency of chrome-tanning[J]. China Leather, 2002, 31(15): 10-12.

[12] EVANS A N, MILLIGAN B, MONTGOMERY K C. Collagen crosslinking: new binding sites for mineral tannage[J]. Journal of the American Leather Chemists Association, 1987, 82(4): 86-95.

[13] FRIESS W. Collagen-biomaterial for drug delivery[J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 1998, 45(2): 113-136.

[14] BUBNIS W A, OFNER III C M. The determination of □-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometrie method using trinitrobenzenesulfonic acid[J]. Analytical Biochemistry, 1992, 207(1): 129-133.

[15] HU Y, LIU L, GU Z P, et al. Modification of collagen with a natural derived cross-linker, alginate dialdehyde[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 102: 324-332. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.11.050.

[16] GIRAUD-GUILLE M M, BESSEAU L, CHOPIN C, et al. Structural aspects of fish skin collagen which forms ordered arrays via liquid crystalline states[J]. Biomaterials, 2000, 21(9): 899-906. DOI:10.1016/ S0142-9612(99)00244-6.

[17] 張之寶, 王靜潔, 陳暉娟, 等. 圓二色譜研究膠原模擬多肽三螺旋結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2014, 34(4): 1050-1055.

[18] LIU J, XU Z, CHEN Y, et al. 1-Butyl-3-methylimidazolium acetate as an alternative solvent for type I collagen[J]. Journal of the American Leather Chemists Association, 2014, 109(7): 189-196.

[19] SREERAMA N, WOODY R W. Poly (Pro) II helixes in globular proteins: identification and circular dichroic analysis[J]. Biochemistry, 1994, 33(33): 10022-10025.

[20] ZHANG Z K, LI G Y, SHI B. Physicochemical properties of collagen, gelatin and collagen hydrolysate derived from bovine limed split wastes[J]. Journal Society of Leather Technologists and Chemists, 2006, 90(1): 23-28.

[21] CONSONNI R, ZETTA L, LONGHI R, et al. Conformational analysis and stability of collagen peptides by CD and by1H and13C NMR spectroscopies[J]. Biopolymers, 2000, 53: 99-111.

Effect of Acetylation on Biological Activity and Structure of Collagen

XU Zhou1,2, LIU Jie3, CHEN Yi1, FAN Haojun1,*
(1. Key Laboratory for Leather Chemistry and Engineering, Ministry of Education, Sichuan University, Chengdu 610065, China; 2. College of Life Science and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China; 3. School of Leather Chemistry and Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353, China)

In this study, acyla ted collagen from pig skin was prepared by succinic anhydride modification. The degree of retention of the collagen triple helix structure was detected by instrumental analysis, and then the biological activity of acylated collagen was further investigated through atomic force microscopy and fibroblast culture. The results showed that the acylation degree of collagen was 62.4%, and the isoelectric point of acylated collagen decreased to 4.1. X-Ray diffraction (XRD) analysis, thermal denaturation temperature determination, and circular dichroism analysis indicated that the triple helix structure of collagen was not destroyed after modification by succinic anhydride. The acetylated collagen presented specific fiber structure under atomic force microscope. Fibroblast culture experiments showed the acetylated collagen could be compatible with fibroblast cells, and partly promote their proliferation. To conclude, acetylation does not destroy the biological activity and structure of collagen.

collagen; succinic anhydride; bioactivity

10.7506/spkx1002-6630-201601003

TS201.3

A

1002-6630（2016）01-0012-05

徐洲, 劉潔, 陳意, 等. 丁二?；瘜?duì)膠原生物活性結(jié)構(gòu)的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 12-16. DOI:10.7506/spkx1002-

6630-201601003. http://www.spkx.net.cn

XU Zhou, LIU Jie, CHEN Yi, et al. Effect of acetylation on biological activity and structure of collagen[J]. Food Science, 2016, 37(1): 12-16. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601003. http://www.spkx.net.cn

2015-06-30

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（51273128；20976110）

徐洲（1984—），男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)化學(xué)與工程。E-mail：zhxu23@126.com

*通信作者：范浩軍（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楦叻肿硬牧?。E-mail：fanhaojun@scu.edu.cn