張根生，丁小君，于 敏，程健博，丁 健

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

復合乳酸菌發(fā)酵降低蛋黃液中膽固醇的工藝優(yōu)化

張根生，丁小君，于 敏，程健博，丁 健

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

為降低蛋黃液中膽固醇含量，選擇出降膽固醇效果較好的3 種菌作為復合發(fā)酵菌種，將復合菌株接種到蛋黃液中，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用直接皂化-比色法探討了復合乳酸菌對蛋黃液中膽固醇降低率的影響，利用正交試驗優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。結果表明，最佳工藝條件為發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時間24 h、接種量3%、牛膽鹽質量濃度3 g/L、混合菌種（嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌）菌液體積比1∶2∶1，在此條件下，可使蛋黃中膽固醇降低率達31.5%。

復合乳酸菌；蛋黃液；降解率；比色法

膽固醇是人體合成荷爾蒙以及組成神經細胞的不可缺少的重要物質，營養(yǎng)學家推薦食物膽固醇的攝入量為250～300 mg/（d·人）[1]。攝入過多會使血清中的膽固醇升高，誘發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病[2]。雞蛋中膽固醇幾乎都來自于蛋黃，單個雞蛋中膽固醇含量約為213 mg[3]，已經接近人們每天的最大攝入量，使得人們對蛋黃中膽固醇的含量有些擔心。因此，低膽固醇蛋黃食品逐漸成為近年來的研究熱點。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB），是指一群發(fā)酵糖類產生大量乳酸的細菌的總稱，是公認的安全微生物。它對人體腸胃、血脂都能起到良好的調節(jié)作用，及其增強免疫力等[4]。國內外大量研究證明乳酸菌可以降低人體中膽固醇含量[5]。國外對于降低膽固醇乳酸菌的研究起步較早，近些年國內外對于采用乳酸菌降低膽固醇的研究也有相應的一些報道。Taranto等[6]證實了純培養(yǎng)條件下部分乳酸菌和兩歧雙歧桿菌對膽固醇有吸收作用。Mott等[7]對仔豬進行研究發(fā)現(xiàn)，飼喂嗜酸乳桿菌的小豬仔與正常小豬仔相比較，前者血清膽固醇含量小于后者。何臘平等[8]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以降低膽固醇降低，通過對培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵的方式進行討論。王成濤等[9]利用原生質融合技術將芽孢桿菌和嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌這3 種乳酸菌進行遠緣雜交，構建出高效降解膽固醇、產乳酸的優(yōu)勢功能菌，并應用于食品發(fā)酵，王一鳴[10]、劉娟[11]等選取乳酸菌來降低膽固醇也有較好效果。

通過把乳酸菌這類益生菌應用到蛋黃液中，以降低其膽固醇含量，從而應用到食品中制作成健康又美味的低膽固醇蛋黃食品，例如蛋黃醬、蛋黃餅干、蛋黃派等，必將成為未來的發(fā)展趨勢。近年來國內利用復合乳酸菌降低蛋黃液中膽固醇的研究較少，并且多數(shù)研究都是微生物與培養(yǎng)基中膽固醇直接培養(yǎng)。本研究直接把復合乳酸菌接入蛋黃液中，并對加入復合乳酸菌的混合菌種比例、接種量、牛膽鹽質量濃度等因素進行探討，并采用正交試驗優(yōu)化各項技術參數(shù)，以確定最佳的膽固醇降低率。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

鮮雞蛋 市售。

嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌，由哈爾濱商業(yè)大學畜產品研究室提供。

結晶膽固醇、甲醇、三氯化鐵、磷酸三鈉、濃硫酸、氫氧化鉀、無水乙醇、石油醚（均為分析純）天津市天新精細化工開發(fā)中心。

1.2 儀器與設備

JJ-1型電動攪拌器 上海浦東物理光學儀器廠；ALC-2100.2型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；V-5000型分光光度儀 上海元析儀器有限公司；TG1850-WS型臺式高速離心機 北京奧博通光學儀器有限公司；HWS型恒溫水浴鍋 上?；厶﹥x器制造有限公司；HD-1630超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋黃液預處理

取新鮮雞蛋，濾去蛋清，留下蛋黃液，攪勻放入燒杯中備用。

1.3.2 MRS培養(yǎng)基的制備[12]

蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、檸檬酸二銨2 g、吐溫-80 1 mL、瓊脂20 g、酵母提取物5 g、MgSO40.58 g ，加入1 000 mL蒸餾水，于121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3.3 3 種乳酸菌菌懸液的制備

取準備好的3 株菌種，在無菌條件下，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，2%的接種量傳代2～3 次，直至恢復活力，0～4 ℃冰箱中低溫保藏。

1.3.4 乳酸菌生長曲線的測定

將活化完全的乳酸菌按體積分數(shù)2%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔3 h測定含有乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基的pH值和OD600nm值。連續(xù)測定48 h，繪制乳酸菌的生長曲線。

1.3.5 拮抗實驗

選取3 種乳酸菌，分別是嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌，按復合菌液體積比1∶1∶1接種到已滅菌的脫脂乳培養(yǎng)基上，放入40 ℃的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，進行鏡檢。

1.3.6 膽固醇含量的測定

標準曲線的繪制[13]：取質量濃度為1 mg/mL的膽固醇原液，用甲醇稀釋成0.04 mg/mL膽固醇標準母液。分別吸取膽固醇標準母液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，并移入25 mL比色管，用甲醇定容至2 mL，再加入2 mL硫磷鐵顯色劑，冷卻室溫后，以甲醇做空白用分光光度計在550 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線，吸光度（Y，A550nm）與膽固醇含量（X，mg/mL）的線性回歸方程表示為Y=0.108 9X－0.109 3（R2=0.993 7），線性關系較好，可用于進行下一步的實驗。

蛋黃液中膽固醇的提取和測定[14]：準確 稱取3 g蛋黃勻液，置于25 mL比色管中，用蒸餾水定容至刻度，得到稀釋液。準確吸取1 mL稀釋液于100 mL燒杯中，加入3 mL 0.1 g/mL氫氧化鈉溶液和10 mL無水乙醇溶液攪勻，在60 ℃水浴直接皂化1 h后取出，冷卻后置于一定溫度下水浴，加入10 mL石油醚溶劑，攪勻，萃取一段時間，量取上清液后吸取0.5 mL于50 mL點量瓶中，置于水浴鍋下?lián)]干，帶有殘渣的燒杯中分別加入2 mL甲醇溶液和2 mL硫磷鐵顯色劑，待室溫后，以溶劑代替蛋黃稀釋液做空白，用分光光度計在550 nm波長處比色，按照公式（1）、（2）計算出膽固醇降低率。

式中：ρ為提取液中膽固醇的質量濃度/（μg/mL）；V為提取液體積/mL；m為蛋黃勻液質量/g。

式中：m1為發(fā)酵后蛋黃液中膽固醇含量/mg；m2為標準蛋黃液中膽固醇含量/mg。

1.4 復合菌種工藝參數(shù)對蛋黃液中膽固醇降低率的影響單因素試驗

1.4.1 復合菌種體積比對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

以3%的復合菌種接入蛋黃液中，復合菌種（嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌）菌液體積比分別為1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1在40 ℃的溫度下發(fā)酵24 h，按1.3.6節(jié)進行測定，按公式（1）、（2）計算膽固醇降低率。

1.4.2 接種量對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接入蛋黃液中，菌種（嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌）體積比為1∶2∶1，在溫度為40 ℃條件下發(fā)酵24 h，按1.3.6節(jié)進行測定，考察對蛋黃液中膽固醇降低率的影響。

1.4.3 牛膽鹽質量濃度對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

在MRS培養(yǎng)基中分別加入0、1、2、3、4 g/L牛膽鹽后接入蛋黃液中，在40 ℃條件下培養(yǎng)24 h，按1.3.6節(jié)進行測定，考察對蛋黃液中膽固醇降低率的影響。

1.4.4 發(fā)酵時間對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

以接種量為3%接種于蛋黃液中，復合菌種（嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌）菌液體積比例為1∶2∶1，在40 ℃條件下培養(yǎng)，每隔4 h測一次樣，按1.3.6節(jié)進行測定，考察對蛋黃液中膽固醇降低率的影響。

1.4.5 發(fā)酵溫度對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

將活化好的菌種在6 000 r/min條件下離心10 min，所得菌懸液中加入3 g/L的牛膽鹽，以3%的接種量接入蛋黃液中，分別放入培養(yǎng)溫度為36、37、38、39、40、41、42 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按1.3.6節(jié)進行測定，考察對蛋黃液中膽固醇降低率的影響。

1.5 混合菌種工藝參數(shù)對蛋黃液中膽固醇降低率影響的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以膽固醇降低率為指標，選取接種量、發(fā)酵時間、牛膽鹽質量濃度為試驗因素，每個因素選取3 個水平，采用L9（34）正交表進行優(yōu)化試驗。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

圖1 乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of lactobacilli

由圖1可知，0～6 h是乳酸菌的延滯期，在這段時間內細胞繁殖緩慢，數(shù)量增長較少，乳酸菌的延滯期較短；6～24 h為乳酸菌的對數(shù)生長期，在此階段乳酸菌的數(shù)量呈對數(shù)生長，菌種代謝和繁殖加快；24～36 h是植物乳桿菌的穩(wěn)定生長期，在穩(wěn)定期乳酸菌的活菌數(shù)達到最高并且基本保持不變，代謝產物不斷積累；36～48 h是乳酸菌的衰亡期，乳酸菌的活菌數(shù)略有降低，菌種活性降低并趨于停滯。

2.2 嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌拮抗實驗結果在顯微鏡下觀察3 種混合菌的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)3 種菌形態(tài)清晰，生長很好，并且3 種菌在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后菌數(shù)也有所增加，3 種菌基本保持了平均的比例，通過3 次平行實驗，可以表明3 種菌基本上沒有拮抗，能夠互利共生，可以混合后作為降低蛋黃液中膽固醇含量的菌種。

2.3 混合菌種體積比對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

圖2 混合菌種體積比對蛋黃液中膽固醇降低率的影響Fig.2 Effect of proportion of mixed strains on the reduction rate of cholesterol

由圖2可知，復合菌種（嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌）體積比為1∶2∶1時，膽固醇降低率達到最高，這可能是由于嗜酸乳桿菌耐酸性強，可以在其他乳酸菌不能生長的環(huán)境中繁殖，并且把嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌混合在一起后，這兩種乳酸菌都起到了促進了嗜酸乳桿菌生長的作用，因此達到了很好的降低膽固醇的效果。這與范興藝[15]提到的嗜酸乳桿菌可以促進其他乳酸菌生長的結論幾乎一致。這3 種菌種早已廣泛應用于乳酸菌飲品中，各項技術都很成熟?？紤]到膽固醇的降解率和產品品質等方面，所以優(yōu)先選擇1∶2∶1。

2.4 接種量對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

圖3 不同接種量對蛋黃液中膽固醇降低率的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on the reduction rate of cholesterol

按照復合菌種體積比在1∶2∶1的情況下，對不同接種量對蛋黃液中膽固醇降低率的影響進行測定，由圖3可知，接種量對蛋黃液中膽固醇降低率的影響較大，接種量1%～3%的范圍內，隨著接種量的增加，膽固醇降低率不斷升高，當接種量超過3%之后，隨著接種量的持續(xù)增加，蛋黃液中膽固醇降低率基本不變。這是由于乳酸菌在蛋黃液中生長的過程中產生乳酸，使得在發(fā)酵過程中其pH值降低，導致部分乳酸菌死亡，因此接種量在3%之后，膽固醇降低率基本不再變化。李昵[16]在乳酸菌降低膽固醇的研究中，也得出在3%的接種量時膽固醇降低率達到最大值，這是由于發(fā)酵培養(yǎng)基pH值較低時，不利于乳酸菌的生長。因此合理的活菌數(shù)即能使膽固醇含量降到最低。

2.5 牛膽鹽質量濃度對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

圖4 牛膽鹽質量濃度對蛋黃液中膽固醇降低率的影響Fig.4 Effect of bile concentration on the reduction rate of cholesterol

由圖4可知，牛膽鹽質量濃度為0～1 g/L，復合乳酸菌發(fā)酵24 h時，膽固醇降低率在0～6%之間，幾乎沒有表現(xiàn)出膽固醇的脫除能力；牛膽鹽質量濃度上升到2 g/L后，膽固醇降低率迅速增加，達到了15%以上；牛膽鹽質量濃度達到3 g/L時，膽固醇降低率達到了30%左右，此后，膽固醇降低率基本穩(wěn)定下來，不再隨牛膽鹽質量濃度的增加而增高，實驗證明，牛膽鹽質量濃度在3～4 g/L時，膽固醇降低率達到最高。其原因是由于適當?shù)呐Ｄ扄}質量濃度可以提高菌體細胞的通透性，促進膽固醇吸收，吸收后的膽固醇與乳酸菌菌體結合后轉化成膽固醇氧化酶，最后導致環(huán)境中的膽固醇含量降低。張紅星等[17]說明了牛膽鹽有助于膽固醇含量的降低。Buck[18]、Noh[19]等也研究出過高的牛膽鹽質量濃度會抑制菌體生長，不利于膽固醇被乳酸菌菌體完全吸收的觀點相一致。

2.6 發(fā)酵時間對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

圖5 發(fā)酵時間對蛋黃液中膽固醇降低率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the degradation rate of cholesterol

有學者認為膽固醇的去除與菌體生長有密切的關系[20]，如圖5所示，在菌體的培養(yǎng)初期（0～8 h）乳酸菌正處于生長的滯留期，菌體生長緩慢，并且活菌數(shù)相對很低，所以膽固醇降低率相對較低，然而隨著發(fā)酵時間的延長（8～24 h），菌體生長相對活躍，活菌數(shù)急劇增加，這個階段菌種就進入了對數(shù)生長期，蛋黃液中膽固醇含量急劇下降，在發(fā)酵24 h左右達到了最大值，膽固醇降低率達到了31.2%。而在培養(yǎng)后期（24～32 h），膽固醇降低率基本不變，這可能是由于在菌體生長后期，一部分菌種到達了衰亡期，導致部分菌種死亡，使得膽固醇降低率在發(fā)酵24 h后不再增加[21]，任大勇等[22]在研究發(fā)酵時間對膽固醇降低率的影響中說明，培養(yǎng)23 h左右膽固醇降低率達到最大值，和本實驗在24 h時膽固醇降低率達到最大值的結論基本一致。

2.7 發(fā)酵溫度對蛋黃液中膽固醇降低率的影響

圖6 發(fā)酵溫度對蛋黃液中膽固醇降低率的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on the degradation rate of cholesterol

由圖6可知，加入復合菌發(fā)酵后，在不同的發(fā)酵溫度下蛋黃液中膽固醇含量都低于正常的蛋黃液，當發(fā)酵溫度達到40 ℃時，膽固醇降低率幾乎達到最大，當達到40 ℃以上乳酸菌的活菌數(shù)下降，所以導致在40～42 ℃時膽固醇降低率基本保持不變。靳志敏等[23]在研究溫度對膽固醇降低率的影響中發(fā)現(xiàn)溫度高于40 ℃時，活菌數(shù)不再升高，并逐步下降，這與圖6中所得結論幾乎一致。

2.8 正交試驗優(yōu)化結果

表1 復合乳酸菌發(fā)酵降低蛋黃液中膽固醇的工藝參數(shù)正交試驗設計方案及結果Table1 Orthogonal array design with experimental results

表2 方差分析Table2 Analysis of variance

由表1、2可知，3 個因素對試驗結果影響程度的主次關系是C＞A＞B，說明發(fā)酵過程中影響膽固醇降低率的主要因素是接種量，其次為發(fā)酵溫度和牛膽鹽質量濃度。正交試驗優(yōu)化結果顯示：通過對A2B2C2組合與A2B2C3組合進行比較，膽固醇降低率分別為29.93%、31.50%，故選擇A2B2C3為最優(yōu)組合，該條件下測得膽固醇降低率為31.50%。

3 結 論

本實驗對復合乳酸菌對膽固醇的降低率及影響因素進行研究，并確定了最佳接種量為3%、發(fā)酵時間24 h，牛膽鹽質量濃度3 g/L、混合菌種（嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌）體積比1∶2∶1及發(fā)酵溫度40 ℃。結果表明，復合乳酸菌比單個乳酸菌降低蛋黃液中膽固醇含量的效果要好。采用復合乳酸菌發(fā)酵來降低蛋黃液中膽固醇含量可為生產低膽固醇蛋黃食品提供有利方法。

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Optimization of Fermentation Conditions for Cholesterol Reduction in Egg Yolk by Mixed Lactobacillus Culture

ZHANG Gensheng, DING Xiaojun, YU Min, CHENG Jianbo, DING Jian
(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Egg yolk was inoculated with a mixed culture of three strains with high cholesterol-reducing capacity and kept in a thermostatic oven in order to maximize cholesterol reduction. Direct saponifi cation-colorimetry method was used to measure the reduction rate of cholesterol. The fermentation conditions were optimized using an orthogonal array design as follows: fermentation temperature, 40 ℃; fermentation time, 24 h; inoculum amount, 3%; bile salt concentration, 3 g/L; and the proportion of mixed strains, 1:2:1 (Streptococcus thermophilus:Lactobacillus acidophilus:Bifi dobacterium). Under these conditions, the cholesterol in egg yolk was reduced by 31.5%.

mixed Lactobacillus; egg yolk; cholesterol degradation; colorimetric method

10.7506/spkx1002-6630-201603034

TS251.5

A

1002-6630（2016）03-0186-05

張根生, 丁小君, 于敏, 等. 復合乳酸菌發(fā)酵降低蛋黃液中膽固醇的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 186-190. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603034. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Gensheng, DING Xiaojun, YU Min, et al. Optimization of fermentation conditions for cholesterol reduction in egg yolk by mixed Lactobacillus culture[J]. Food Science, 2016, 37(3): 186-190. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603034. http://www.spkx.net.cn

2015-06-27

張根生（1964—），男，教授，碩士，研究方向為畜產品加工。E-mail：zhanggsh@163.com