馬增暉　闞秋霞　河北省遷安市農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局064400

貉產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌的分離鑒定

馬增暉闞秋霞河北省遷安市農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局064400

大腸埃希菌（E.coli），俗稱大腸桿菌，存在于人和動物腸道內(nèi)。某些血清型可導(dǎo)致腹瀉，稱為致病性大腸桿菌，產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC）便是其中一種。據(jù)報道，ETEC在腹瀉病例中的檢出率為20％～70％。

ETEC是導(dǎo)致人畜腹瀉的主要致病菌。病原性大腸桿菌一般以O(shè)抗原進行分型。到目前為止，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從不同種類的動物中分離出幾十種血清型的大腸桿菌，然而關(guān)于貉產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌的研究則很少報道。

大腸桿菌是條件性致病菌，某些血清型可引起貉腹瀉。飼養(yǎng)管理不當(dāng)，飼料品質(zhì)差，陰雨連綿，飲用臟水等都可提高腹瀉的發(fā)病率和貉的死亡率，給養(yǎng)貉業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。為探討分離菌的致病性和與貉腹瀉死亡的關(guān)系，從理論上揭示發(fā)病機理，以及有效地指導(dǎo)臨床防治，特從遷安某養(yǎng)殖場送檢的病死貉體內(nèi)分離出3株產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌并對其生物學(xué)特性進行初步探討，取得了滿意的結(jié)果?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　材料

（1）被檢材料。被檢材料來源于遷安縣某養(yǎng)殖場送檢的發(fā)病貉。

（2）培養(yǎng)基及試劑。普通營養(yǎng)瓊脂、7％綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、CAYE-2培養(yǎng)液、伊紅美藍瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基及生化鑒定用試劑按常規(guī)方法配制。

（3）微量糖發(fā)酵管及藥敏紙片。微量發(fā)酵管由上海醫(yī)學(xué)化驗所試劑廠生產(chǎn)，批號：20030802。藥敏紙片由北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號：20040314。

（4）藥品及儀器。剪刀、手術(shù)刀、酒精、托盤、培養(yǎng)基平板、接種環(huán)、試管、溫箱和高壓滅菌器等均由本單位實驗室提供。

（5）試驗動物。用于毒素型鑒定動物是體重2kg的兔；用于致病性試驗的動物是20日齡健康小白鼠和體重2kg的兔。以上動物均購于遷安某養(yǎng)殖場。

2　方法

（1）發(fā)病情況。據(jù)養(yǎng)殖戶介紹，40多只母貉中2只產(chǎn)出的18只仔貉，有14只發(fā)病，其中5只死亡，發(fā)病率為78％，死亡率為28％。

（2）臨床癥狀。10～40日齡仔貉易感，食欲廢絕，精神極度沉郁，急性型無明顯臨床癥狀，突然死亡，部分仔貉下痢，體溫不高。無菌采取腸系膜淋巴結(jié)、肝臟和脾臟供分離培養(yǎng)用。

（3）病理變化。對病死貉進行剖檢，可見脾出血，淤血，腫大；肝出血，淤血，腫大；腎淤血，表面有少量針尖大的壞死灶，腸道膨脹，內(nèi)有多量積液，腸系膜淋巴結(jié)有出血點，腫脹。

（4）病原菌分離培養(yǎng)。無菌操作取腹瀉死亡貉心血、腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾等分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂、7％綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48小時，觀察細菌生長情況及菌落特征。選取呈優(yōu)勢生長的菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24小時形成純培養(yǎng)物，保存，供進一步鑒定用。

（5）細菌形態(tài)觀察。無菌采取腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟直接觸片，以及分離菌純培養(yǎng)物涂片后，革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡觀察。同時采用節(jié)思明氏莢膜染色法和復(fù)紅美藍芽孢染色法進行莢膜、芽孢檢查。

（6）細菌生化試驗。取上述3株純培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)48小時，按常規(guī)方法接種進行生化反應(yīng)測定。接種于5％半固體高層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基做運動力檢查。

（7）毒素型鑒定。采用兔回腸結(jié)扎試驗，兔預(yù)先饑餓48小時，CAYE-2培養(yǎng)濾液于每個回腸段注射1mL，同時設(shè)置未接種細菌的CAYE-2培養(yǎng)濾液作為陰性對照。18小時后處死兔取出結(jié)扎腸段，測定每個腸段的長度和液體潴積量。以每厘米腸段內(nèi)蓄液量≥1mL者為陽性反應(yīng)，表示被檢菌能產(chǎn)生熱敏腸毒素LT。

（8）藥敏試驗。按常規(guī)抗菌藥物敏感紙片法對分離菌進行藥敏試驗。取以上3株純培養(yǎng)后菌體均勻涂片于普通瓊脂培養(yǎng)基，稍干后將待測抗菌藥物敏感紙片按梅花形粘貼于合適的位置上，37℃溫箱中培養(yǎng)48小時，測定抑菌圈直徑，并判定其抗菌藥物敏感性。判斷標(biāo)準(zhǔn)：以抑菌圈直徑小于10mm為耐藥、11～15mm為中度敏感、16mm以上為高度敏感。

（9）致病性試驗。取上述3株純培養(yǎng)物接種于普通營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)48小時，按0.2mL/只（每mL約含109CFU）腹腔接種于20日齡健康小白鼠，同時按1mL/只（每mL約含109CFU）肌肉接種兔進行致病作用檢查，用相同劑量無菌普通營養(yǎng)肉湯和相同途徑分別接種20日齡健康小白鼠、兔作為對照，接種后隔離飼養(yǎng)觀察72小時，以發(fā)病或死亡作為感染與否的判定指標(biāo)，及時剖解觀察病死動物，并從肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)、心血中分離回收攻毒菌。

2　結(jié)果

（1）細菌形態(tài)特征。細菌涂片，革蘭氏染色后鏡檢，可見大量革蘭氏陰性桿菌，其分離菌形態(tài)一致，菌體兩端著色較深，中等大小，多數(shù)單個存在，無芽孢，有微莢膜，有鞭毛，能運動，短小、兩端鈍圓，個別呈短鏈狀排列。

（2）細菌培養(yǎng)特性。鏡檢為陰性的分離菌經(jīng)37℃培養(yǎng)24～48小時在普通瓊脂平板上形成圓形、光滑濕潤、隆起、邊緣整齊、半透明的淡灰白色菌落，直徑2～3mm，在綿羊血平板上呈β溶血。在麥康凱平板上形成紅色菌落，在伊紅美藍瓊脂上則形成中心黑色并有金屬光澤的菌落。營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)物混濁，形成菌環(huán)。

（3）分離菌運動性及生化特性鑒定。半固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱培養(yǎng)24小時，細菌沿穿刺線擴散生長，表明分離菌有運動性。上述3株菌培養(yǎng)所表現(xiàn)的生化特性基本一致，進行糖發(fā)酵試驗，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、鼠李糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，蔗糖試驗陽性。甲基紅和靛基質(zhì)試驗陽性。V.P試驗和檸檬酸鹽利用試驗均為陰性。還原硝酸鹽。不分解尿素。賴氨酸試驗陽性，不液化明膠，接觸酶試驗陽性。結(jié)果見表1。

表1　生化特性鑒定結(jié)果

（4）毒素型鑒定。試驗組共注射三個腸段，均潴積大量的液體，經(jīng)測定每厘米腸段內(nèi)蓄液量平均為1.2mL，陰性對照平均為0.6mL，證明被檢菌能產(chǎn)生熱敏腸毒素。

（5）抗菌藥物敏感試驗。采用常規(guī)紙片法對上述3株分離菌進行了藥物敏感性測定，結(jié)果所表現(xiàn)的敏感性基本一致，均對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、羧芐青霉素和氟哌酸高度敏感，對丁胺卡那霉素中度敏感，對先鋒霉素、鏈霉素、四環(huán)素和土霉素表現(xiàn)出耐藥性。結(jié)果見表2。

（6）致病性。上述3株分離菌株對小白鼠和兔的致病性試驗結(jié)果見表3。從表3中可以看出，3株分離菌株腹腔接種小白鼠和肌肉接種兔均具有高致病性，致死率均為100％。注射肉湯培養(yǎng)物的小白鼠和兔于72小時死亡，死后剖檢，肝臟、脾臟、腎臟腫大色暗紅，質(zhì)地變脆，腸膨脹。內(nèi)臟涂片，革蘭氏染色，可見大量革蘭氏陰性中等大小之桿菌，與從病死貉分離的細菌是完全一致的。而對照組小白鼠和兔則全部健康存活。經(jīng)培養(yǎng)和生化特性鑒定與接種菌相一致。證明所分離菌為產(chǎn)毒素型大腸桿菌。結(jié)果見表3。

表2　抗菌藥物敏感試驗結(jié)果

表3　致病性試驗結(jié)果

3　小結(jié)

（1）根據(jù)細菌發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化，結(jié)合分離菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性、致病性，以及腸毒素測定，確定所分離的細菌為能產(chǎn)生熱敏腸毒素（LT）的產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌。

（2）研究資料表明，消化道是產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌（ETEC）侵入機體的主要途徑，而產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌主要通過菌體表面的一種對宿主有特異性的粘附因子粘附到小腸黏膜表面并不斷繁殖，分泌腸毒素，引起腸黏膜細胞水與電解質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致腹瀉。目前常見的粘附因子有CFA/Ⅰ，CFA/Ⅱ，K88，K99，987P和F41等。ETEC可產(chǎn)生兩種腸毒素，即耐熱性腸毒素（ST）和熱敏性腸毒素（LT）。腸毒素試驗結(jié)果表明，我們所分離的菌株能產(chǎn)生LT毒素，而與K88，K99，987P單因子血清不發(fā)生反應(yīng)，說明腸毒素是導(dǎo)致仔貉腹瀉死亡的直接原因。ETEC粘附因子、腸毒素與其致病性三者之間存在一定的相關(guān)關(guān)系，粘附因子具有很強的表面粘附能力，是ETEC致病的基礎(chǔ)，腸毒素是ETEC致病的主要原因。但如果ETEC失去表達粘附因子的能力，那么ETEC進入小腸也不會引起腹瀉。試驗結(jié)果表明，所分離的菌株可產(chǎn)生LT毒素，在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)48小時可表達豐富的菌毛，同時對小白鼠和兔均具有很高的致病性。從表3中可以看出，所分離的菌株腹腔接種小白鼠和肌肉接種兔均具有高致病性，致死率均為100％。

（3）隨著抗菌藥物在生產(chǎn)中大量和不規(guī)范的使用，使得抗菌藥物耐藥菌株不斷增多，在生產(chǎn)中若不進行藥敏試驗來指導(dǎo)用藥，極易影響藥物的治療效果，造成經(jīng)濟損失。藥敏測試結(jié)果表明，病菌均對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、羧芐青霉素、氟哌酸高度敏感，對丁胺卡那霉素中度敏感，對先鋒霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素表現(xiàn)出耐藥性。選用高度敏感的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林應(yīng)用于治療，收到了較好的效果，在生產(chǎn)中可考慮優(yōu)先使用。