馬增暉　闞秋霞　河北省遷安市農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局064400

貉產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌的分離鑒定

馬增暉闞秋霞河北省遷安市農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局064400

大腸埃希菌（E.coli），俗稱大腸桿菌，存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)。某些血清型可導(dǎo)致腹瀉，稱為致病性大腸桿菌，產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC）便是其中一種。據(jù)報(bào)道，ETEC在腹瀉病例中的檢出率為20％～70％。

ETEC是導(dǎo)致人畜腹瀉的主要致病菌。病原性大腸桿菌一般以O(shè)抗原進(jìn)行分型。到目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從不同種類的動(dòng)物中分離出幾十種血清型的大腸桿菌，然而關(guān)于貉產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌的研究則很少報(bào)道。

大腸桿菌是條件性致病菌，某些血清型可引起貉腹瀉。飼養(yǎng)管理不當(dāng)，飼料品質(zhì)差，陰雨連綿，飲用臟水等都可提高腹瀉的發(fā)病率和貉的死亡率，給養(yǎng)貉業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。為探討分離菌的致病性和與貉腹瀉死亡的關(guān)系，從理論上揭示發(fā)病機(jī)理，以及有效地指導(dǎo)臨床防治，特從遷安某養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的病死貉體內(nèi)分離出3株產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步探討，取得了滿意的結(jié)果?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料

（1）被檢材料。被檢材料來(lái)源于遷安縣某養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的發(fā)病貉。

（2）培養(yǎng)基及試劑。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、7％綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、CAYE-2培養(yǎng)液、伊紅美藍(lán)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基及生化鑒定用試劑按常規(guī)方法配制。

（3）微量糖發(fā)酵管及藥敏紙片。微量發(fā)酵管由上海醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)：20030802。藥敏紙片由北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)：20040314。

（4）藥品及儀器。剪刀、手術(shù)刀、酒精、托盤、培養(yǎng)基平板、接種環(huán)、試管、溫箱和高壓滅菌器等均由本單位實(shí)驗(yàn)室提供。

（5）試驗(yàn)動(dòng)物。用于毒素型鑒定動(dòng)物是體重2kg的兔；用于致病性試驗(yàn)的動(dòng)物是20日齡健康小白鼠和體重2kg的兔。以上動(dòng)物均購(gòu)于遷安某養(yǎng)殖場(chǎng)。

2　方法

（1）發(fā)病情況。據(jù)養(yǎng)殖戶介紹，40多只母貉中2只產(chǎn)出的18只仔貉，有14只發(fā)病，其中5只死亡，發(fā)病率為78％，死亡率為28％。

（2）臨床癥狀。10～40日齡仔貉易感，食欲廢絕，精神極度沉郁，急性型無(wú)明顯臨床癥狀，突然死亡，部分仔貉下痢，體溫不高。無(wú)菌采取腸系膜淋巴結(jié)、肝臟和脾臟供分離培養(yǎng)用。

（3）病理變化。對(duì)病死貉進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)脾出血，淤血，腫大；肝出血，淤血，腫大；腎淤血，表面有少量針尖大的壞死灶，腸道膨脹，內(nèi)有多量積液，腸系膜淋巴結(jié)有出血點(diǎn)，腫脹。

（4）病原菌分離培養(yǎng)。無(wú)菌操作取腹瀉死亡貉心血、腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾等分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、7％綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況及菌落特征。選取呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的菌落接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24小時(shí)形成純培養(yǎng)物，保存，供進(jìn)一步鑒定用。

（5）細(xì)菌形態(tài)觀察。無(wú)菌采取腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟直接觸片，以及分離菌純培養(yǎng)物涂片后，革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡觀察。同時(shí)采用節(jié)思明氏莢膜染色法和復(fù)紅美藍(lán)芽孢染色法進(jìn)行莢膜、芽孢檢查。

（6）細(xì)菌生化試驗(yàn)。取上述3株純培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，按常規(guī)方法接種進(jìn)行生化反應(yīng)測(cè)定。接種于5％半固體高層營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基做運(yùn)動(dòng)力檢查。

（7）毒素型鑒定。采用兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)，兔預(yù)先饑餓48小時(shí)，CAYE-2培養(yǎng)濾液于每個(gè)回腸段注射1mL，同時(shí)設(shè)置未接種細(xì)菌的CAYE-2培養(yǎng)濾液作為陰性對(duì)照。18小時(shí)后處死兔取出結(jié)扎腸段，測(cè)定每個(gè)腸段的長(zhǎng)度和液體潴積量。以每厘米腸段內(nèi)蓄液量≥1mL者為陽(yáng)性反應(yīng)，表示被檢菌能產(chǎn)生熱敏腸毒素LT。

（8）藥敏試驗(yàn)。按常規(guī)抗菌藥物敏感紙片法對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。取以上3株純培養(yǎng)后菌體均勻涂片于普通瓊脂培養(yǎng)基，稍干后將待測(cè)抗菌藥物敏感紙片按梅花形粘貼于合適的位置上，37℃溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)定抑菌圈直徑，并判定其抗菌藥物敏感性。判斷標(biāo)準(zhǔn)：以抑菌圈直徑小于10mm為耐藥、11～15mm為中度敏感、16mm以上為高度敏感。

（9）致病性試驗(yàn)。取上述3株純培養(yǎng)物接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，按0.2mL/只（每mL約含109CFU）腹腔接種于20日齡健康小白鼠，同時(shí)按1mL/只（每mL約含109CFU）肌肉接種兔進(jìn)行致病作用檢查，用相同劑量無(wú)菌普通營(yíng)養(yǎng)肉湯和相同途徑分別接種20日齡健康小白鼠、兔作為對(duì)照，接種后隔離飼養(yǎng)觀察72小時(shí)，以發(fā)病或死亡作為感染與否的判定指標(biāo)，及時(shí)剖解觀察病死動(dòng)物，并從肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)、心血中分離回收攻毒菌。

2　結(jié)果

（1）細(xì)菌形態(tài)特征。細(xì)菌涂片，革蘭氏染色后鏡檢，可見(jiàn)大量革蘭氏陰性桿菌，其分離菌形態(tài)一致，菌體兩端著色較深，中等大小，多數(shù)單個(gè)存在，無(wú)芽孢，有微莢膜，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，短小、兩端鈍圓，個(gè)別呈短鏈狀排列。

（2）細(xì)菌培養(yǎng)特性。鏡檢為陰性的分離菌經(jīng)37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)在普通瓊脂平板上形成圓形、光滑濕潤(rùn)、隆起、邊緣整齊、半透明的淡灰白色菌落，直徑2～3mm，在綿羊血平板上呈β溶血。在麥康凱平板上形成紅色菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂上則形成中心黑色并有金屬光澤的菌落。營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)物混濁，形成菌環(huán)。

（3）分離菌運(yùn)動(dòng)性及生化特性鑒定。半固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)菌沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)，表明分離菌有運(yùn)動(dòng)性。上述3株菌培養(yǎng)所表現(xiàn)的生化特性基本一致，進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、鼠李糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，蔗糖試驗(yàn)陽(yáng)性。甲基紅和靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性。V.P試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)均為陰性。還原硝酸鹽。不分解尿素。賴氨酸試驗(yàn)陽(yáng)性，不液化明膠，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　生化特性鑒定結(jié)果

（4）毒素型鑒定。試驗(yàn)組共注射三個(gè)腸段，均潴積大量的液體，經(jīng)測(cè)定每厘米腸段內(nèi)蓄液量平均為1.2mL，陰性對(duì)照平均為0.6mL，證明被檢菌能產(chǎn)生熱敏腸毒素。

（5）抗菌藥物敏感試驗(yàn)。采用常規(guī)紙片法對(duì)上述3株分離菌進(jìn)行了藥物敏感性測(cè)定，結(jié)果所表現(xiàn)的敏感性基本一致，均對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、羧芐青霉素和氟哌酸高度敏感，對(duì)丁胺卡那霉素中度敏感，對(duì)先鋒霉素、鏈霉素、四環(huán)素和土霉素表現(xiàn)出耐藥性。結(jié)果見(jiàn)表2。

（6）致病性。上述3株分離菌株對(duì)小白鼠和兔的致病性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可以看出，3株分離菌株腹腔接種小白鼠和肌肉接種兔均具有高致病性，致死率均為100％。注射肉湯培養(yǎng)物的小白鼠和兔于72小時(shí)死亡，死后剖檢，肝臟、脾臟、腎臟腫大色暗紅，質(zhì)地變脆，腸膨脹。內(nèi)臟涂片，革蘭氏染色，可見(jiàn)大量革蘭氏陰性中等大小之桿菌，與從病死貉分離的細(xì)菌是完全一致的。而對(duì)照組小白鼠和兔則全部健康存活。經(jīng)培養(yǎng)和生化特性鑒定與接種菌相一致。證明所分離菌為產(chǎn)毒素型大腸桿菌。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　抗菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

表3　致病性試驗(yàn)結(jié)果

3　小結(jié)

（1）根據(jù)細(xì)菌發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化，結(jié)合分離菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性、致病性，以及腸毒素測(cè)定，確定所分離的細(xì)菌為能產(chǎn)生熱敏腸毒素（LT）的產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌。

（2）研究資料表明，消化道是產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌（ETEC）侵入機(jī)體的主要途徑，而產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌主要通過(guò)菌體表面的一種對(duì)宿主有特異性的粘附因子粘附到小腸黏膜表面并不斷繁殖，分泌腸毒素，引起腸黏膜細(xì)胞水與電解質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致腹瀉。目前常見(jiàn)的粘附因子有CFA/Ⅰ，CFA/Ⅱ，K88，K99，987P和F41等。ETEC可產(chǎn)生兩種腸毒素，即耐熱性腸毒素（ST）和熱敏性腸毒素（LT）。腸毒素試驗(yàn)結(jié)果表明，我們所分離的菌株能產(chǎn)生LT毒素，而與K88，K99，987P單因子血清不發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明腸毒素是導(dǎo)致仔貉腹瀉死亡的直接原因。ETEC粘附因子、腸毒素與其致病性三者之間存在一定的相關(guān)關(guān)系，粘附因子具有很強(qiáng)的表面粘附能力，是ETEC致病的基礎(chǔ)，腸毒素是ETEC致病的主要原因。但如果ETEC失去表達(dá)粘附因子的能力，那么ETEC進(jìn)入小腸也不會(huì)引起腹瀉。試驗(yàn)結(jié)果表明，所分離的菌株可產(chǎn)生LT毒素，在營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)48小時(shí)可表達(dá)豐富的菌毛，同時(shí)對(duì)小白鼠和兔均具有很高的致病性。從表3中可以看出，所分離的菌株腹腔接種小白鼠和肌肉接種兔均具有高致病性，致死率均為100％。

（3）隨著抗菌藥物在生產(chǎn)中大量和不規(guī)范的使用，使得抗菌藥物耐藥菌株不斷增多，在生產(chǎn)中若不進(jìn)行藥敏試驗(yàn)來(lái)指導(dǎo)用藥，極易影響藥物的治療效果，造成經(jīng)濟(jì)損失。藥敏測(cè)試結(jié)果表明，病菌均對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、羧芐青霉素、氟哌酸高度敏感，對(duì)丁胺卡那霉素中度敏感，對(duì)先鋒霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素表現(xiàn)出耐藥性。選用高度敏感的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林應(yīng)用于治療，收到了較好的效果，在生產(chǎn)中可考慮優(yōu)先使用。