殷　嫻，　龐冬洽，　韓瑞枝，　李江華，　劉　龍， 堵國成， 陳　堅*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

優(yōu)化黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體形成條件及表達系統(tǒng)的建立

殷嫻1，2，龐冬洽2，韓瑞枝2，李江華1，2，劉龍1，2， 堵國成1，2， 陳堅*1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

優(yōu)化了黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體形成條件并建立基因表達系統(tǒng)。利用酶解法制備原生質(zhì)體，最優(yōu)的酶解液配比為5mg/mL溶壁酶、0.2 U/mL幾丁質(zhì)酶和460 U/mL葡萄糖醛酸酶。最優(yōu)的滲透壓穩(wěn)定劑為0.7mol/L KCl，菌絲層厚度50μm，菌體量為0.003 g/mL。在培養(yǎng)基中添加1 mmol/LMn2+有助于減少原生質(zhì)體形成所需的酶量，在培養(yǎng)基中添加葡萄糖醛酸酶有助于得到獨立的孢子進行萌發(fā)，從而促進原生質(zhì)體的形成。利用共轉(zhuǎn)化的方式，可以同時將兩個表達框整合到基因組上并實現(xiàn)基因表達。

黑曲霉；檸檬酸；原生質(zhì)體；共轉(zhuǎn)化

黑曲霉 （Aspergillus niger）是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌，作為生物反應(yīng)器廣泛應(yīng)用于酶、抗生素、有機酸等物質(zhì)的生產(chǎn)。隨著黑曲霉基因組測序工作的完成以及對黑曲霉基因組表達譜進行挖掘，黑曲霉的代謝網(wǎng)絡(luò)模型不斷得到完善，黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸機制和高效分泌蛋白質(zhì)的機制得到更深層次的闡述［1-2］，通過分子改造對黑曲霉的代謝進行調(diào)控來實現(xiàn)目的產(chǎn)物的積累已經(jīng)有諸多成功的報道［3-5］。但是，這些報道所使用的菌株均非檸檬酸生產(chǎn)菌株，目前還沒有對檸檬酸生產(chǎn)菌株進行遺傳轉(zhuǎn)化來積累目標產(chǎn)物的報道。不同株系的黑曲霉基因組差別巨大［1］，基因表達的差異造成其形態(tài)差異明顯，細胞壁成分也有所不同。因此，需要建立黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株的表達系統(tǒng)。

絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法主要有4種：電轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和PEG介導(dǎo)法。電擊轉(zhuǎn)化法是以原生質(zhì)體或者完整的細胞為受體的轉(zhuǎn)化方法。利用短暫的電場脈沖作用，使生物膜的類脂分子層發(fā)生瞬時混亂，膜通透性瞬時增大，使DNA進入細胞。由于質(zhì)膜的可修復(fù)性，外加電場造成的膜穿孔在一定時間內(nèi)可自動修復(fù)，使細胞恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)，但該方法對黑曲霉的轉(zhuǎn)化效率極低［6］。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是根瘤農(nóng)桿菌A.tumefaciens通過類似結(jié)合的過程把Ti質(zhì)粒中的T-DNA轉(zhuǎn)移到受體細胞基因組中。在產(chǎn)酶黑曲霉中，該轉(zhuǎn)化方法獲得成功的應(yīng)用［7］，但對產(chǎn)酸黑曲霉轉(zhuǎn)化效率很低?；驑尫ㄗ鳛橐环N萬能基因轉(zhuǎn)化法，可以直接將外源DNA導(dǎo)入可再生的細胞，但缺點是價格昂貴、嵌合體不易排除、不易選擇轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)化頻率低以及轉(zhuǎn)化受體細胞再生困難，目前尚無在黑曲霉中應(yīng)用的報道。PEG介導(dǎo)法是目前在黑曲霉中應(yīng)用最廣泛的方法，轉(zhuǎn)化材料為原生質(zhì)體。原生質(zhì)體作為受體細胞具有群體數(shù)量大、容易獲得純合性的轉(zhuǎn)化子等優(yōu)點，但原生質(zhì)體具有培養(yǎng)難度大、再生頻率低和周期長等缺點。該方法已經(jīng)在野生菌株 A.niger N400［8-9］、N402［3，5］中應(yīng)用。在來源于N402的pyrG缺陷型菌株AB4.1［10］、野生型菌株CAD4［11］、NW185的pyrA缺陷型菌株NW186［4］以及糖化酶生產(chǎn)菌株BO-1［12］中獲得應(yīng)用。野生型菌株和產(chǎn)酶菌株可以控制真菌形態(tài)，使其長成長絲狀菌絲，易于制備原生質(zhì)體，而本研究使用的黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株H915-1未能通過培養(yǎng)基優(yōu)化得到長絲狀菌體，而始終以粗短菌絲存在，故而原生質(zhì)體制備非常困難。

作者對黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株H915-1的原生質(zhì)體形成條件進行了優(yōu)化，從酶解液成分與配比、酶解作用條件和菌體生長條件三方面入手，系統(tǒng)探索了PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法，建立了遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，提供了始終只能以粗短菌絲存在的黑曲霉的原生質(zhì)體制備的方法，為進一步改造黑曲霉工業(yè)生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒黑曲霉H915-1：江蘇國信協(xié)聯(lián)能源有限公司檸檬酸生產(chǎn)菌株；構(gòu)巢曲霉：南京師范大學(xué)陸玲教授惠贈；pUC18和pMD19：TaKaRa公司；E.coli JM109：Stratagene公司；pRS303：作者所在實驗室保存。

1.1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

1）LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0，固體培養(yǎng)基添加1.5 g/ dL的瓊脂粉。篩選培養(yǎng)基需加入100μg/mL氨芐青霉素或硫酸卡那霉素。

2）LB孢子萌發(fā)培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L；pH 5.0。

3）ME培養(yǎng)基：麥芽提取物 30 g/L，胰蛋白胨5 g/L。

4）上層培養(yǎng)基：麥芽提取物 30 g/L，胰蛋白胨5 g/L，1.2mol/L山梨醇，1 g/dL的瓊脂。

5）下層培養(yǎng)基：麥芽提取物 30 g/L，胰蛋白胨5 g/L，1.2mol/L山梨醇，1.5 g/dL的瓊脂，加入相應(yīng)抗生素。

以上培養(yǎng)基均為121℃滅菌15min。

6）MC緩沖液：50 mmol/L CaCl2，20 mmol/L Mes/NaOH，pH 5.8。

7）STC緩沖液：1.2 mol/L山梨醇，50 mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris，pH 7.5。

8）PEG緩沖液：25%PEG 6000，50mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris，pH 7.5。

1.2實驗方法

1.2.1黑曲霉和構(gòu)巢曲霉基因組的提取在茄子瓶中用ME斜面培養(yǎng)黑曲霉H915-1或構(gòu)巢曲霉，35℃倒置培養(yǎng)5～7 d至長出濃密孢子，加入5 mL 0.1%Tween-20，用接種鏟刮取孢子，用mirocloth過濾除去菌絲體，孢子液經(jīng)稀釋后用血球計數(shù)器計數(shù)。按3×105CFU/mL接種孢子至ME液體培養(yǎng)基，35℃、200 r/min培養(yǎng)2 d，用mirocloth收集菌球，并擠壓干水分。按照DNeasy Plant Mini Kit說明書提取絲狀真菌基因組。

1.2.2表達載體的構(gòu)建

1）pMHT載體的構(gòu)建：mbf啟動子通過引物mbf-F和mbf-R-hph從黑曲霉基因組中克隆得到，hph基因通過引物mbf-F-hph和hph-R-trpC以pRS303為模板得到，trp終止子通過引物hph-F-trpC和trp-R從構(gòu)巢曲霉基因組中克隆得到，通過融合PCR構(gòu)建Pmbf-hph-Ttrp表達框，并連接到pMD19上得到pMHT。轉(zhuǎn)化黑曲霉的抗性表達框為通過引物mbf-F和trp-R，以pMHT為模板擴增得到3 300 bp的片段。

2）pGGT載體的構(gòu)建：gpdA啟動子通過引物gpd-F和gpd-R從構(gòu)巢曲霉基因組中克隆得到，序列的5'和3'端分別加入Sma I和Bam HI位點，sGFP參照文獻由全序列合成得到［13］，序列5'和3'端分別加入Bam HI和Pst I位點，trp終止子通過trp-F和trp-R以pMHT為模板擴增得到，序列的5'和3'端分別加入Pst I和Hin d III位點。PgpdA-sGFP-Ttrp表達框通過酶切連接構(gòu)建。Ttrp由Hin dⅢ和 PstⅠ酶切，sGFP由 PstⅠ和 Bam HI酶切，PgpdA由XmaⅠ和Bam HI酶切，3個片段依次連接到pUC18上，得到pGGT。轉(zhuǎn)化黑曲霉的GFP表達框為通過引物gpd-F和trp-R，以pGGT為模板擴增得到3 800 bp的片段。

利用引物hph-F1和hph-R1鑒定hph整合的轉(zhuǎn)化子，利用引物GFP-F1和GFP-R1鑒定sGFP整合的轉(zhuǎn)化子。

載體構(gòu)建和鑒定重組子整合所用到的引物見表1。

表1　引物序列Table 1　Primer sequences

1.2.3黑曲霉H915-1原生質(zhì)體的制備按3×105CFU/mL的濃度接種孢子至ME液體培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。用mirocloth收集菌球，并用無菌水清洗菌球。稱取一定量的酶，并用含不同滲透壓穩(wěn)定劑的MC溶解，用無菌濾膜過濾除菌。稱取一定量菌球加入到酶解液中，37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)2～4 h，4℃、2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入相同體積預(yù)冷的STC，4℃、1 000 r/min離心10 min，棄上清液，洗滌2次，加入100μL STC，混勻得到原生質(zhì)體懸液，可直接用于轉(zhuǎn)化。

1.2.4原生質(zhì)體再生將原生質(zhì)體懸液在顯微鏡下用血球計數(shù)板進行計數(shù)A，用STC溶液進行適當(dāng)稀釋，涂布于上層培養(yǎng)基上。35℃培養(yǎng)1～2 d至單菌落出現(xiàn)，進行計數(shù)B。為消除菌絲體片段形成菌落造成的誤差，等量稀釋的原生質(zhì)體涂布于ME固體培養(yǎng)基，菌落計數(shù)C。再生率計算公式：原生質(zhì)體再生率=［（B-C）/A］×100%。

1.2.5PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉原生質(zhì)體100μL黑曲霉原生質(zhì)體中加入1μg質(zhì)粒和330μL PEG緩沖液，冰上放置20 min，加入2 mL PEG，室溫放置10min，依次加入4mL STC和4mL于48℃預(yù)熱的上層培養(yǎng)基，鋪板于含有180 mg/L潮霉素的下層培養(yǎng)基上。平板在33℃倒置培養(yǎng)3～7 d，直至出現(xiàn)菌落，挑取單菌落傳代。

2　結(jié)果與討論

2.1原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

2.1.1黑曲霉H915-1細胞壁消化的酶復(fù)合液成分比例的優(yōu)化黑曲霉的細胞壁成分主要是葡聚糖和幾丁質(zhì)［1，14］，此外，β-葡萄糖醛酸酶的酶活作用影響原生質(zhì)體形成效率［14］。不同株系的黑曲霉細胞壁成分略有差別，黑曲霉CBS 513.88只用溶壁酶一種成分即可消化得到黑曲霉原生質(zhì)體，黑曲霉K10僅需使用蝸牛酶即可獲得原生質(zhì)體，找到合適的細胞壁裂解酶的配比是制作原生質(zhì)體的基礎(chǔ)［15］。對酶復(fù)合液的成分和比例進行了優(yōu)化。對于黑曲霉H915-1，單獨使用蝸牛酶和溶壁酶都無法獲得原生質(zhì)體，當(dāng)使用復(fù)合酶液均可以得到原生質(zhì)體，但效果不同。當(dāng)使用溶壁酶、幾丁質(zhì)酶和葡萄糖醛酸酶時，相較于其它種類的酶解液得到的原生質(zhì)體數(shù)最多，進一步優(yōu)化該酶解液中各酶濃度，發(fā)現(xiàn)5 mg/mL溶壁酶、0.2 U/mL幾丁質(zhì)酶和460 U/mL葡萄糖醛酸酶時，得到的原生質(zhì)體數(shù)目最多，為6.7×105個/mL，見表2。對于H915-1，溶壁酶破壞葡聚糖，幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)，β-葡萄糖醛酸酶促進破壞細胞間的粘附作用，這3種酶共同作用得到最優(yōu)的原生質(zhì)體酶解條件。消化酶的濃度需要嚴格的界定，任意一種酶的過量都會造成原生質(zhì)體濃度下降。一方面，由于原生質(zhì)體是從細胞壁間隙擠出，需要配合間隙大?。ㄓ上富钚钥刂疲?、胞內(nèi)外滲透壓差和轉(zhuǎn)速來完成原生質(zhì)體的形成和釋放；另一方面，消化酶對細胞膜具有破壞作用，過量的酶會造成細胞的損傷，這也可能與消化酶并非純酶有關(guān)，商品化的酶雖然經(jīng)過純化但依然含有大量雜質(zhì)。

表2　原生質(zhì)體形成的酶復(fù)合液的優(yōu)化Table 2　Im provement of A.niger protoplasting w ith different digest enzyme

2.1.2酶解作用條件的優(yōu)化滲透壓穩(wěn)定劑的種類對原生質(zhì)體形成有重要影響，不僅可以保護原生質(zhì)體減慢膨脹破裂的速度，而且其中的離子可能會對酶起激活作用。絲狀真菌原生質(zhì)體形成所需的滲透壓穩(wěn)定劑包括無機鹽類的 KCl、NH4Cl、MgSO4、（NH4）2SO4［16］等，有機物穩(wěn)定劑為山梨醇和甘露醇。Arati Das的研究認為，黑曲霉原生質(zhì)體形成的最適滲透壓穩(wěn)定劑是MgCl2［17］，Charissa de Bekker則以山梨醇為滲透壓穩(wěn)定劑來制備黑曲霉原生質(zhì)體［17］。有機物穩(wěn)定劑可以提高原生質(zhì)體制備時離心收集的回收率，因此盡可能選用有機物穩(wěn)定劑提供滲透壓。選擇了原生質(zhì)體制備常用的滲透壓穩(wěn)定劑，由圖1（a）可知，H915-1在0.9 mol/L KCl中易形成原生質(zhì)體，在0.4 mol/LMgSO4和0.8 mol/L山梨醇溶液中，菌絲體很少被消化，只有極少量原生質(zhì)體形成，而且不同的消化酶成分在這兩種滲透壓穩(wěn)定劑下都很難促使原生質(zhì)體生成，只有以KCl為滲透壓穩(wěn)定劑時，原生質(zhì)體大量形成。細胞壁本身帶負電荷，具有吸附陽離子的功能［19］，可能細胞壁成分的差異造成了陽離子吸附量的差異，對酶解液的酶活有影響，從而找到合適的滲透壓穩(wěn)定劑是原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵因素之一。

KCl的濃度與原生質(zhì)體形成相關(guān)，只有胞外滲透壓略低于胞內(nèi)滲透壓引起黑曲霉細胞膨脹，才會從被酶解的細胞壁間隙“排”出原生質(zhì)體，當(dāng)原生質(zhì)體滲出到一定程度，適當(dāng)程度的振動使原生質(zhì)體脫離菌絲，形成游離的原生質(zhì)體。滲透壓穩(wěn)定劑濃度越低，原生質(zhì)體產(chǎn)生的速度越快，但其膨脹速度也快，最終破裂，因此低滲溶液的原生質(zhì)體穩(wěn)定性差，為此需要確認最佳的滲透壓穩(wěn)定劑濃度，由圖1（b）可知最適的KCl濃度為0.7mol/L，可以得到9×105個/mL原生質(zhì)體，0.9 mol/L KCl得到的原生質(zhì)體數(shù)略低，而在0.5 mol/L KCl中消化后的得到的原生質(zhì)體比0.7 mol/L KCl減少了2/3，說明低滲溶液嚴重影響了原生質(zhì)體的形成和穩(wěn)定性。

菌體量是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵因素，過量的菌體意味著酶的底物增加，會造成被酶解的細胞壁間隙變小，菌絲消化不徹底會導(dǎo)致原生質(zhì)體制備失?。欢w量不足會造成原生質(zhì)體數(shù)量的減少。如圖1（c）所示，在5 mL酶解液中，制備H915-1原生質(zhì)體的最適菌體量為15 mg，增加菌體量會導(dǎo)致原生質(zhì)體量急劇減少，20 mg的菌體量是15 mg菌體量產(chǎn)生的原生質(zhì)體量的1/5。

溫度對原生質(zhì)體形成的影響在于酶液在不同溫度下的酶活及酶的穩(wěn)定性不同，而原生質(zhì)體形成需要用到3種酶，葡萄糖醛酸酶和幾丁質(zhì)酶的最適溫度為37℃，但幾丁質(zhì)酶在37℃的穩(wěn)定性較差，因此需要考察它們在不同溫度下的協(xié)同作用，由圖1（d）可見，37℃是比較適合的酶作用溫度。

圖1　酶解作用條件的優(yōu)化Fig.1　Optim ization of digestion conditions for protoplasting

酶解時間對獲得原生質(zhì)體的影響在于需要盡可能完全消化掉菌絲體，但維持時間不宜過長，以減少低滲及酶的作用造成的原生質(zhì)體破裂及活力下降。酶解1 h，菌絲體即被消化成原生質(zhì)體。酶解2 h時，原生質(zhì)體被釋放到酶解液中，且獲得的原生質(zhì)體活性較好，存活率為95%以上。酶解3 h時，原生質(zhì)體存活率下降至85%，見圖2。

圖2　黑曲霉原生質(zhì)體的形成和釋放Fig.2　A.niger protoplasts formed from mycelium

2.1.3菌體生長條件的優(yōu)化菌絲體的菌齡對原生質(zhì)體形成有重要影響。在20mLME培養(yǎng)基中接種107個孢子，30℃、200 r/min培養(yǎng)不同時間。由圖3可知，孢子由分散的狀態(tài)逐漸粘附到固形顆粒上；8 h時，固形顆粒上粘附了大量的孢子，且固形顆粒也相互粘連在一起，此時孢子吸脹；12 h時，孢子剛萌發(fā)出菌絲，形成菌球；16 h的菌球更大，菌絲層剛好完全包裹住固形顆粒及孢子；20 h的菌絲層更厚，菌球形狀更規(guī)則，趨于圓形。

制備原生質(zhì)體需要幼嫩的菌絲，孢子萌發(fā)初期的菌絲體更容易被降解。但隨著培養(yǎng)時間的縮短，菌絲可能無法完全包裹住菌球，造成ME固形物裸露于酶解液中，被酶解為小碎片。其混雜于原生質(zhì)體中，不僅影響酶液降解菌絲體，并且無法與原生質(zhì)體分離，影響后續(xù)化學(xué)轉(zhuǎn)化；相反，隨著菌齡增加，菌球更大，表層疏散的菌絲體被消化后，開始消化內(nèi)部連接較為緊密的菌絲體，見圖3。此時，由于負責(zé)降解細胞間的粘連作用的葡萄糖醛酸酶只能作用于表層菌絲，因此形成大量未分散的原生質(zhì)體團，且粘連在固形顆粒上，為使原生質(zhì)體團分散，只能延長酶解時間，而酶解時間的延長造成早期形成的原生質(zhì)體的損失，為此需要確定黑曲霉在ME中培養(yǎng)的時間，即菌絲層厚度對原生質(zhì)體形成的影響。由圖4可知，30℃、200 r/min培養(yǎng)16 h得到的原生質(zhì)體最多，此時的菌絲層厚度為50μm左右。

圖3　黑曲霉H915-1在ME培養(yǎng)基中的生長Fig.3　Grow th of A.niger H 915-1 in ME medium

圖4　培養(yǎng)時間對原生質(zhì)體形成的影響Fig.4　Effect of culture time on protoplasting

為減少制備原生質(zhì)體的成本，需要盡可能減少幾丁質(zhì)酶的用量。通過在菌體生長階段添加Mn2+，考察最終將等量菌體在相同時間內(nèi)完全消化成原生質(zhì)體所需的幾丁質(zhì)酶的用量，見表3。在不添加Mn2+時，幾丁質(zhì)酶濃度需要0.2 U/mL；添加Mn2+至1mg/mL和10 mg/mL，幾丁質(zhì)酶用量可以減少1/2。Mn2+對黑曲霉合成檸檬酸有重要影響［19］，同時也反映了它對黑曲霉細胞壁合成、孢子形成和次級代謝產(chǎn)物的合成有重要影響［20］。在缺乏Mn2+時，細胞壁含有更高含量的幾丁質(zhì)，而本研究中添加Mn2+顯著減少了制備原生質(zhì)體所需的幾丁質(zhì)酶的用量。

表3　培養(yǎng)基中添加M nCl2對原生質(zhì)體形成的影響Table 3　M nCl2addition in ME medium facilitated A. niger protoplasting

黑曲霉在孢子萌發(fā)前首先進行聚集，因此黑曲霉是以菌絲聚集體的形式存在于液體培養(yǎng)基中。為增加菌體與酶解液的接觸面積，促進消化，期望孢子以單體形式萌發(fā)，而不形成菌球。葡萄糖醛酸酶具有減少原生質(zhì)體間粘附的作用［6］，在LB孢子萌發(fā)培養(yǎng)基中添加460 U/mL葡萄糖醛酸酶，獲得了分散生長的孢子，見圖5。以萌發(fā)的孢子取代菌球進行酶解，完全消化菌絲體的時間從2 h縮短至1.5 h，獲得的原生質(zhì)體量提升了20%。獲得分散的孢子還可以在其它方面進行應(yīng)用，比如利用流式細胞儀進行轉(zhuǎn)化后篩選已經(jīng)在動物細胞中獲得廣泛的應(yīng)用［21］，利用GFP為標記基因，不需要繁雜的抗性篩選，直接用流式細胞儀即可篩選陽性克隆，而且由于篩選的是單個細胞，因此可以避免嵌合體的產(chǎn)生。但這個方法需要獲得單個的營養(yǎng)細胞，本研究提供了獲得獨立的萌發(fā)孢子的方法，為后續(xù)研究提供技術(shù)支撐。

圖5　葡萄糖醛酸酶作用下孢子的萌發(fā)Fig.5　Conidia grew separated inmediaw ith glucuronidase

2.2sGFP在黑曲霉H 915-1中的整合表達

利用PEG介導(dǎo)法，將線性化的sGFP表達框和hph表達框（圖6a）進行共轉(zhuǎn)化（片段比例為10∶1），共得到31個轉(zhuǎn)化子有持續(xù)的潮霉素抗性，提取轉(zhuǎn)化子的基因組進行PCR鑒定，所有的潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子均能擴增到hph條帶（圖6b），為整合表達hph的轉(zhuǎn)化子。其中有18個轉(zhuǎn)化子的基因組可以擴增出sGFP條帶（圖6c），為整合hph和sGFP兩個片段的轉(zhuǎn)化子，片段共整合的概率為58%，圖7為轉(zhuǎn)化子表達GFP在藍光激發(fā)光下的熒光。在高等生物中，主要利用非同源末端連接進行外源片段對基因組的整合［22-23］，利用該方式，可以同時使多個片段整合到基因組上，是目前改造高等生物包括真菌最常用的方式。本研究針對菌絲粗短的黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌株建立了高效的原生質(zhì)體制備方法并建立了PEG介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化方法，為后續(xù)改造此類黑曲霉奠定了基礎(chǔ)。

圖6　共轉(zhuǎn)化表達框示意圖及轉(zhuǎn)化子基因組的PCR鑒定Fig.6　Structures of cassettes for co-transformation and PCR am plification for gene insertion in genomes of transformants

圖7　黑曲霉菌絲體表達sGFP在激發(fā)光下產(chǎn)生綠色熒光Fig.7　sGFP expression in A.niger hyphae

3　結(jié)語

黑曲霉是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌，作為絲狀真菌，對其進行遺傳改造最有效的方法是PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體法，實驗的關(guān)鍵是制備有活力的原生質(zhì)體，但一般需要對長絲狀菌絲體進行消化來進行原生質(zhì)體的制備，而檸檬酸生產(chǎn)菌H915-1在培養(yǎng)基中始終以短粗菌絲存在，故需要建立其適用的原生質(zhì)體制備方法并建立遺傳轉(zhuǎn)化方法。本文對酶解液成分與配比、酶解作用條件和菌體生長條件三方面進行系統(tǒng)優(yōu)化，確定了原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件。此外，鑒于Mn2+對黑曲霉細胞壁合成、孢子形成和次級代謝產(chǎn)物的合成有重要影響，本文通過在菌體生長時添加Mn2+可以減少原生質(zhì)體形成所需的酶量，并通過葡萄糖醛酸酶的添加獲得了獨立萌發(fā)的孢子，對其進行處理可以進一步促進原生質(zhì)體的形成。最終以PEG介導(dǎo)法實現(xiàn)了兩個表達框的共轉(zhuǎn)化，且基因在黑曲霉中可以進行穩(wěn)定的表達。該方法的建立為代謝改造黑曲霉檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

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Protop lasting Im provement of Industrial Citrate-Producing Aspergillus niger for DNA Transformation

YIN Xian1，2，PANG Dongqia2，HAN Ruizhi2，LIJianghua1，2，LIU Long1，2，DU Guocheng1，2，CHEN Jian1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Thisarticleaimedtooptim izeprotoplast formationconditionsof industrial citrate-producing Aspergillus niger to establish genetic transformation system.As protoplasts were formed by enzyme digestion，components of enzyme m ixtures，digestion conditions and hyphae grow th conditionswere studied.The optimized enzymem ixture contained 5mg/m L lysing enzyme，0.2 U/m L chitinase and 460 U/m L glucuronidase.The best conditions for protoplasting were using 0.7 M KCl as osmotic stabilizer，thickness of pellets hyphae for 50μm，cellweight of 0.003 g/m L. Furthermore，addition ofMn2+in culturemedium helped reduce the chitinase concentration necessary for protoplasting.In addition，glucuronidase in culturemedium facilitated conidia separation during germination，further improved protoplast formation.Finally，two cassetteswere inserted into genomesimultaneously.

Aspergillus niger，citric acid，protoplast，co-transformation

Q 93

A

1673—1689（2016）09—0963—08

2015-01-14

江蘇省研究生創(chuàng)新工程項目（CXZZ11_0477）；江南大學(xué)博士研究生科學(xué)研究基金（JUDCF11008）。

殷 嫻（1982—），女，江蘇無錫人，發(fā)酵工程博士研究生。E-mail：yinxianshirley@yahoo.com.cn

陳堅（1962—），男，江蘇揚州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)和生化工程方面的研究。E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn