孔德昭，　彭 娟，　劉麗強，　唐麗娟，　匡 華

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的玉米細菌性枯萎病菌快速檢測方法

孔德昭，彭 娟，劉麗強，唐麗娟，匡 華*

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

通過菌體免疫小鼠獲得高靈敏的高特異性單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)建立一種快速、靈敏的單克隆抗體雙抗體夾心法檢測玉米細菌性枯萎病菌（Pantoea stewartill subsp.Stewartii）。通過小鼠脾臟融合實驗獲得3株單克隆抗體（12B4、10B1、11C2），并通過雙抗體夾心法篩選配對細胞株，建立雙抗體夾心法。最低檢測限（LOD）為1.5×104cfu/mL，線性范圍在4.57×105～1.11× 108cfu/mL。該方法對玉米細菌性枯萎病菌具有很好的特異性，對玉米種子添加回收實驗回收率為85.6%～90.2%，相對標準偏差低于5.0%。

玉米細菌性枯萎病菌；單克隆抗體；雙抗體夾心法；玉米

玉米細菌性枯萎病 （Stewart’s BacterialWilt of Corn）是玉米上的一種毀滅性的病害，我國尚無該病害發(fā)生。其病原菌玉米細菌性枯萎病菌，學(xué)名Erwinia stewartii Dye，異名Pawoea stewaritii subsp. stewartii［1］。玉米細菌性枯萎病菌（Pss）屬于腸桿菌科多源菌屬，是一種黃色、不運動、無內(nèi)生孢子、革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，可以引起玉米細菌性枯萎病。1897年首次發(fā)現(xiàn)于美國紐約長島，之后傳播到世界其他地區(qū)［3］。目前已知發(fā)生地區(qū)有加拿大、墨西哥、巴西、秘魯、圭亞那、意大利、波蘭、羅馬尼亞、南斯拉夫、泰國、越南、馬來西亞等。作為一種典型的維管束萎蔫病害，玉米在生長的各個階段均能被玉米細菌性枯萎病菌進行侵染。玉米細菌性枯萎病菌可以通過帶菌種子遠距離傳播（種傳）［4］，在病區(qū)則以昆蟲傳播為主，如玉米跳甲等。在國際貿(mào)易中，帶菌昆蟲和病株不易成為傳播途徑，因此帶菌種子是該病遠距離傳播的主要因素，是傳入無病區(qū)的主要侵染源，病菌存在于種子的內(nèi)、外部。我國目前尚未發(fā)現(xiàn)玉米細菌性枯萎病的發(fā)生，但傳入風(fēng)險很高，已經(jīng)列為我國進境一類檢疫對象，只有證實未染菌的玉米產(chǎn)品才可以入境。在1992年農(nóng)業(yè)部頒布的《中華人民共和國進境植物檢疫危險性病、蟲、雜草名錄》中，被列為一類危險性有害生物。

對玉米細菌性枯萎病菌的檢測診斷方法包括野外觀察、生理生化鑒定［5］、免疫學(xué)檢測和鑒定［6-7］以及PCR檢測技術(shù)［8-9］，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)［10］和生物傳感技術(shù)［11］也被用來檢測玉米細菌性枯萎病菌。

但生化檢測技術(shù)耗時過長，且檢測結(jié)果存在不可靠性。PCR檢測技術(shù)具有很好的靈敏性與準確性，但由于依賴于昂貴的儀器和專業(yè)的檢測人員，不適用于大量產(chǎn)品的快速檢測。ELISA檢測技術(shù)依賴于高度特異性與靈敏性的抗體，在檢測靈敏度上雖然不如PCR方法，但是由于檢測快速、方便、便宜，因此十分適合于大批量樣品的粗篩檢測。

由于玉米細菌性枯萎病菌會對農(nóng)業(yè)帶來的巨大威脅與損失，因此快速準確的檢測方法顯得尤為重要。因此作者制備了玉米細菌性枯萎病菌的單克隆抗體并建立了雙抗體夾心ELISA法，為玉米細菌性枯萎病菌的快速免疫檢測奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

6種植物病原菌菌株來自英國NCPPB中心（National Collection of Plant Pathogenic Bacteria）：玉米細菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisub sp.stewartii，NCPPB449），丁香假單胞桿菌斑點致病變種（Pseudomonas syringae pv.Maculicola，NCPPB1820），水稻細菌性谷枯病菌 （Burkholderia glumae，NCPPB 3591，NCPPB2391），水 稻 細 菌 性 條 斑 病 菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola，NCPPB 1585），丁香假單胞菌丁香致病變種 （Pseudomonas syringae pv.syringae，NCPPB2844）。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，3，3'，5，5'-；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）明膠：Sigma公司；辣根過氧化酶標記的羊抗兔/鼠IgG：康成生物工程公司產(chǎn)品；玉米種子：購自超市；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（NBY）：北京路橋公司；其余試劑：均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2主要儀器

MK3酶標儀：Thermo scientific；PH050A型培養(yǎng)箱：上海恒一科學(xué)儀器有限公司制造；96孔酶標板：無錫國盛實驗器材有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1植物病菌培養(yǎng)方法玉米細菌性枯萎病菌凍存菌株使用LB培養(yǎng)基，pH 7.0，28℃條件下復(fù)蘇1～2 d，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，28℃培養(yǎng)2～3 d，之后單菌落接種在NBY液體培養(yǎng)基中，pH 7.0，28℃培養(yǎng)2 d。其他菌株首先使用LB培養(yǎng)基復(fù)蘇1～2 d，在營養(yǎng)瓊脂上劃線活化培養(yǎng)2～3 d，然后挑取單菌落接種于M210培養(yǎng)基 （0.8%酶水解干酪素，0.5%蔗糖，0.03%K2HPO4，0.03%MgSO4·7H2O，pH 7.0），37℃培養(yǎng)。

1.3.2玉米細菌性枯萎病菌單克隆抗體的制備滅活的玉米細菌性枯萎病菌使用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度為1010cfu/mL，取一定體積滅活菌體稀釋到適當濃度后與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化至形成油包水結(jié)構(gòu)后，皮下多點注射免疫6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，劑量為108cfu/只，間隔周期為3周，之后使用弗氏不完全佐劑乳化，第3次免疫時劑量減半。3次免疫后小鼠尾部采血并利用間接ELISA檢測血清效價，待效價達到要求后，挑選效價最高的小鼠進行腹腔注射沖刺免疫，劑量為1×107cfu/只。沖刺免疫3 d后，將小鼠處死并取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。融合過程中細胞篩選采用間接ELISA方法挑選對玉米細菌性枯萎病菌具有高親和力的強陽性的孔進行亞克隆并凍存。使用最終凍存的細胞株制備腹水，并采用辛酸飽和硫酸銨法純化得到單克隆抗體。單克隆抗體標記HRP采用NaIO4法，詳細步驟見參考文獻［12］。

1.3.3配對篩選利用雙抗體夾心ELISA法進行單抗配對篩選，操作方法如下：將獲得的玉米細菌性枯萎病菌單抗分別稀釋到6μg/mL包被，封閉，然后加入玉米細菌性枯萎病菌標準品作為陽性對照（1×108cfu/mL，100μL/孔），加入標準品稀釋液作為陰性對照（PBS，100μL/孔），37℃反應(yīng)1 h后，加入HRP標記的單抗 （稀釋1 000倍），37℃反應(yīng)1 h，顯色并終止反應(yīng)，檢測后，取陽性孔吸光值與陰性孔吸光值比值≥2.1的配對進行進一步優(yōu)化，以確定最靈敏的配對并建立標準曲線［13］。

1.3.4玉米細菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA標準曲線的建立以配對優(yōu)化后的ELISA雙抗體夾心法為基礎(chǔ)，建立玉米細菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA標準曲線。將玉米細菌性枯萎病菌用PBS稀釋成一系列濃度，每個濃度做3個重復(fù)，零孔做6個重復(fù)。以玉米細菌性枯萎病菌濃度為橫坐標，對應(yīng)的OD450值為縱坐標繪制標準曲線。根據(jù)繪制的曲線選取最佳的線性范圍。最低檢測限（LOD）為陰性對照孔平均值與3倍標準差之和在標準曲線中所對應(yīng)的濃度。

1.3.5玉米細菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA特異性玉米細菌性枯萎病菌（NCPPB449），丁香假單胞桿菌斑點致病變種（NCPPB1820），水稻細菌性谷枯病菌（NCPPB 3591，NCPPB2391），水稻細菌性條斑病菌（NCPPB 1585），丁香假單胞菌丁香致病變種（NCPPB2844）滅活菌株用PBS稀釋到108cfu/mL，并用建立的ELISA方法檢測，檢測同時做標準曲線作為對照。

1.3.6實際樣品檢測取500 g超市購買的玉米種子，使用0.5%的NaOCl浸泡5～15min進行表面消毒，然后使用無菌生理鹽水沖洗3次，無菌條件下晾干。表面消毒后的檢驗樣品粉碎，適量無菌生理鹽水于4℃條件浸泡過夜。浸泡液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 000 r/min下離心10 min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入另外離心管，10 000 r/mim下離心15min，棄去上清液，加2mL生理鹽水使之懸浮，得到懸液［11］。使用國標免疫分離方法驗證懸液為陰性樣品［14］，即取用的玉米種子未被玉米細菌性枯萎病菌感染。在懸液中添加不同濃度玉米細菌性枯萎病菌 （1×106、5× 106、1×107cfu/mL）作為陽性質(zhì)控，使用懸液作為陰性質(zhì)控，每個濃度做3個重復(fù)。

2　結(jié)果與分析

2.1玉米細菌性枯萎病菌單克隆抗體及配對篩選

經(jīng)過融合篩選共獲得3株對玉米細菌性枯萎病菌強陽性的細胞株，配對篩選結(jié)果見表1。

表1　玉米細菌性枯萎病菌單抗配對結(jié)果Table 1　Pairw ise study of Pantoea stewartii subsp.stewartii m Abs

由結(jié)果可以看出，以抗體11C2作為捕獲抗體，以抗體10B1酶標抗體作為檢測抗體時，所建立的雙抗體夾心法對玉米細菌性枯萎病菌具有較高的靈敏度。進一步優(yōu)化實驗表明，該對抗體配對的靈敏度與檢測范圍均為最佳配對。因此選擇11C2-10B1HRP作為最優(yōu)配對并建立雙抗體夾心法。

2.2玉米細菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA標準曲線的建立

11C2-10B1HRP檢測玉米細菌性枯萎病菌的標準曲線見圖1。

圖1　玉米細菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA標準曲線Fig.1　Standard curve of sandw ich ELISA for Pantoea stewartiisubsp.stewartii

圖1為玉米細菌性枯萎病菌雙抗體夾心法的非線性擬合的標準曲線，該方法對玉米細菌性枯萎病菌檢測的最低檢測限（LOD）為 5×104cfu/mL，定量限（QL）為4.57×105cfu/mL。LOD為0孔平均值加上3倍0孔SD對應(yīng)的菌體濃度。QL為2.1倍的0孔平均值所對應(yīng)的菌體濃度。線性范圍在4.57×105～1.11×108cfu/mL。

2.3玉米細菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA特異性

11C2-10B1HRP雙抗體夾心法檢測玉米細菌性枯萎病菌的特異性見圖2。

圖2　玉米細菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA特異性Fig.2　Specificity of monoclonal sandw ich ELISA for Pantoea stewartiisubsp.stewartii

圖2表明，該雙抗體夾心ELISA方法對玉米細菌性枯萎病菌有很好的特異性，與丁香假單胞桿菌斑點致病變種、水稻細菌性谷枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、丁香假單胞菌丁香致病變種均沒有交叉反應(yīng)。

2.4玉米細菌性枯萎病菌雙抗體夾心ELISA對玉米種子的檢測

為檢驗所建立雙抗體夾心ELISA方法的可靠性，參考國標及文獻，對玉米種子樣品中玉米細菌性枯萎病菌進行定量檢測?；厥章逝c相對標準偏差見表2。在玉米種子樣品的檢測中，對玉米細菌性枯萎病菌的回收率為85.6%～90.2%，相對標準偏差低于5.0%。顯示出所建立的雙抗體夾心ELISA方法在實際樣品檢測中具有較好的準確性與穩(wěn)定性。

表2　雙抗體夾心ELISA對玉米種子中玉米細菌性枯萎病菌的檢測結(jié)果（n=3）Table 2　Result from analysis of Pantoea stewartii subsp. stewartii in incurred corn seed by monoclonal sandw ich ELISA（n=3）

3　結(jié)語

玉米細菌性枯萎病是玉米的一種毀滅性的病害，因此對玉米細菌性枯萎病菌的快速準確的檢測顯得尤為必要。本研究中，我們制備了針對玉米細菌性枯萎病菌的單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法。其最低檢測限（LOD）為1.5×104cfu/mL，線性范圍在4.57×105～1.11×108cfu/mL。該方法對玉米細菌性枯萎病菌具有很好的特異性，對實際樣品檢測具有很好的準確性與穩(wěn)定性，對于實際樣品的快速、準確檢測具有很好的指導(dǎo)意義。

［1］MERGAERT J，VERDONCK L，KERSTERSK.Transfer of erw inia-ananas（synonym，erw inia-uredovora）and erw inia-stewartii to the genus pantoea emend as pantoea-ananas（serrano 1928）comb-nov and pantoea-stewartii（sm ith 1898）comb-nov，respectively，anddescriptionofpantoea-stewartiisubspindologenessubspnov［J］.InternationalJournalofSystematic Bacteriology，1993，43：162-173.

［2］玉米細菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法.SN/T 1375-2004［S］.北京：中國標準出版社，2004.

［3］BLOCK CC，HILL JH，MCGEED C.Seed transmission of Pantoea stewartii in field and sweetcorn［J］.Plant Disease，1998，82（7）：775-780.

［4］M ICHENER PM，PATAKY JK，WHITE D G.Rates of transmitting Erwinia stewartii from seed to seedlings of a sweet corn hybrid susceptible to stewart'sw ilt［J］.Plant Disease，2002，86（9）：1031-1035.

［5］郭翼奮，梁再群，俞大紱.玉米細菌性枯萎病選擇性培養(yǎng)基——黑色素培養(yǎng)基［J］.微生物學(xué)報，1982，4：339-345. GUO Yifen，LIANG Zaiqun，YU Dafu.Nigrosinemedium-Selectivemedium for isolation of Erw inia Stewartii form imported corn［J］.Acta M icrobiogica Sinica，1982，4：339-345.（in Chinese）

［6］ZHANG F，LIJ，ZOU M，et al.Simultaneous detection of Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis and Pantoea stewartiisubsp.stewartii based onm icrosphere immunoreaction［J］.Journal of Biomolecular Screening，2013，18（4）：474.

［7］齊玲玲，金涌，鄒明強，等.膠體金免疫層析試紙條快速檢測玉米細菌性枯萎病菌［J］.檢驗檢疫科學(xué)，2010，20（1）：1-4. QI Lingling，JIN Yong，ZOU M ingqiang，et al.A colloidal gold-based immunochromatographic strip for rapid detection of erw iniastewartiisubsp.stewartii［J］.Journal of Inspection and Quarantine，2010，20（1）：1-4.（in Chinese）

［8］THAPA S P，PARK D H，W ILSON C，et al.Multiplex PCR assay for the detection of Pantoea stewartii subsp.stewartii using species-specific geneticmarkers［J］.Australasian Plant Pathology，2012，41（5）：559-564.

［9］漆艷香，朱水芳，趙文軍，等.玉米細菌性枯萎病菌TaqMan探針實時熒光PCR檢測方法的建立［J］.植物保護學(xué)報，2004，31（1）：51-56. QIYanxiang，ZHU Shuifang，ZHAO Wenjun，et al.Detection and identification of Pantoea stewartii stewartii using TaqMan probe［J］.Journal of Plant Protection，2004，31（1）：51-56.（in Chinese）

［10］袁鈞，高文娜，汪萬春，等.玉米細菌性枯萎病菌LAMP檢測方法的建立［J］.植物檢疫，2013，27（5）：61-65. YUAN Jun，GAO Wenna，WANG Wanchun，et al.LAMP for the detection of Pantoea stewartii subsp.stewartii.［J］.Plant Quarantine，2013，27（5）：61-65.（in Chinese）

［11］XUE Q，QI C.An immunosensor based on magnetic relaxation sw itch and polystyrene m icroparticle-induced immune multivalency enrichment system for the detection of Pantoea stewartii subsp.Stewartii［J］.Biosensors and Bioelectronics，2013，43：6-11.

［12］KUANG H，WANG W B，XU L G，et al.Monoclonal antibody-based sandw ich ELISA for the detection of staphylococcal enterotoxin A［J］.International Journal of Environmental Research and Public Health，2013，10（4）：1598-1608.

［13］PENG J，MENG X，DENG X，et al.Development of a monoclonal antibody-based sandw ich ELISA for the detection of ovalbum in in foods［J］.Food and Agricultural Immunology，2014，25（1）：1-8.

科技信息

加拿大批準一種蛋白酶用于水解蛋白與水解酵母

2016年7月14日加拿大衛(wèi)生部發(fā)布通告，修訂食品酶列表，批準一種產(chǎn)自嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus TP7）的蛋白酶用于水解動物、植物與牛奶蛋白以及水解酵母。

目前加拿大衛(wèi)生部已批準多種有機體來源的蛋白酶用于食品，這包括水解動物、牛奶與植物蛋白。然而尚未批準嗜熱脂肪地芽孢桿菌TP7。經(jīng)過評估，加拿大衛(wèi)生部認為該蛋白酶用于食品是安全的。

［信息來源］食品伙伴網(wǎng).歐盟發(fā)布對孔雀石綠和發(fā)酵大豆提取物的安全性進行評估［EB/OL］.（2016-7-15）.http: //news.foodmate.net/2016/07/387696.html

歐盟批準UV處理的牛奶和反式白藜蘆醇作為新食品

2016年7月19日，歐盟通過歐委會決議EU 2016/1189，同意修訂EC 258/97指令，將UV處理的牛奶和反式白藜蘆醇作為新食品（原料）投放市場。具體要求為：（1）對新食品UV處理的牛奶給出了詳細的定義，并設(shè)定了維生素D3在UV處理的牛奶中的最高限量為0.5～3.2μg/100g（全乳）、0.1～1.5μg/100g（半脫脂乳）；標簽中應(yīng)標明“UV處理”和營養(yǎng)成分中需標明“因UV處理產(chǎn)生的維生素D”含量；（2）新食品原料反式白藜蘆醇，作為膳食補充劑（片劑）提供給成年人服用，每天最大服用量不超過150mg；標簽中應(yīng)標明“反式白藜蘆醇”字樣，并具有“在醫(yī)生監(jiān)督下服用”描述字樣。同時對反式白藜蘆醇片劑的純度、鉛汞等限量要求做出明確的規(guī)定。

［信息來源］國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.歐盟批準UV處理的牛奶和反式白藜蘆醇作為新食品 ［EB/OL］.（2016-7-19）.http://jckspaqj.aqsiq.gov.cn/wxts/gwsp/201607/t20160722_470812.htm

Rapid Detecion of Pantoea stewartii subsp.Stewartii Using Enzyme-Linked Immunoassay

KONG Dezhao，PENG Juan， LIU Liqiang，TANG Lijuan，KUANG Hua*
（State Key Lab of Food Science&Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Asensitiveandrapidmonoclonal antibody-basedsandw ichenzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was established to detect Pantoea stewartill subsp.Stewartii（Pss）. Threemurinehybridomas（12B4/10B1/11C2）wereobtained from the spleen cells fused produce.A pairofmonoclonalantibodies（mAb）wasselected for the sandw ich ELISAmethod.ThemAb 10B1 was conjugated w ith horseradish peroxidase（HRP）as the detection antibody and themAb 11C2was used as the capture antibody.The lim it of detection of thismethod was 1.5×104cfu/m L，and the linear range from 4.57×105to 1.11×108cfu/m L.

Pantoea stewartill subsp.stewartii，monoclonalantibody，sandw ich ELISA，corn

S 432.42

A

1673—1689（2016）09—0958—05

2014-09-17

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAC01B07）。

孔德昭（1990—），男，安徽宣城人，食品安全檢測方向博士研究生。E-mail：kdz19900910@163.com

匡華（1981—），女，河南新鄉(xiāng)人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全方面的研究。E-mail：kuangh@jiangnan.edu.cn