張　悅， 宿玲恰， 吳　敬*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

重組大腸桿菌生產(chǎn)海藻糖合酶發(fā)酵工藝優(yōu)化

張悅1，2， 宿玲恰1，2， 吳敬*1，2

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

為了實現(xiàn)來源于嗜熱棲熱菌的海藻糖合酶的高效表達，對E.coli BL21（DE3）/pET24a（+）-TreS基因工程菌在3 L發(fā)酵罐進行了發(fā)酵工藝優(yōu)化，獲得的最優(yōu)發(fā)酵條件為：誘導溫度32℃，當OD600達到50時以0.2 g/（L·h）的速率補加乳糖進行誘導產(chǎn)酶，在該條件下發(fā)酵35 h時酶活達到472 U/mL，是優(yōu)化前的2.3倍；進而采用該條件在30 L發(fā)酵罐進行了初步放大研究，酶活達到356 U/mL。由于該海藻糖合酶熱穩(wěn)定性好，因此嘗試了高溫處理破碎E.coli細胞以釋放海藻糖合酶，結果表明，80℃處理30 min，海藻糖合酶的得率可達72.3%，具有工業(yè)化應用前景。

海藻糖合酶；高效表達；基因工程菌；發(fā)酵罐；高溫處理

海藻糖 （α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside）是自然界普遍存在的一種非還原性二糖，無色無味，自身性質非常穩(wěn)定［1-2］，能保護生物大分子免受環(huán)境壓力造成的傷害［3］。大量研究結果顯示，海藻糖是蛋白質、生物膜、醫(yī)藥制劑、單細胞生物以及動植物組織和器官的優(yōu)質保護劑［2，4］。海藻糖對酸和熱的高度穩(wěn)定、防止淀粉老化和蛋白質變性、抑制脂肪酸敗、矯味矯臭、高玻璃化轉變溫度、低吸濕性、低甜度等特性，也使它在食品加工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、生化制品業(yè)和化妝品產(chǎn)業(yè)得到廣泛應用，成為上萬種產(chǎn)品的添加劑［5-6］。

早期商品化的海藻糖是從酵母中提取的，該方法生產(chǎn)周期長、提取率低、過程復雜，20世紀90年代之后發(fā)展到酶轉化技術才使海藻糖走進千家萬戶。酶法制備海藻糖分為磷酸化酶法、麥芽寡聚糖基海藻糖合成酶和麥芽寡聚糖基海藻糖水解酶雙酶法以及海藻糖合酶法。在海藻糖的工業(yè)生產(chǎn)中，海藻糖合酶與其他海藻糖合成酶系相比具有更大的優(yōu)勢，只需要一種酶一步反應就能獲得海藻糖，而且其底物為廉價的淀粉水解而得的麥芽糖［7］。海藻糖合酶是一類分子內(nèi)轉糖苷酶，催化麥芽糖和海藻糖之間糖苷鍵的轉化［8］。海藻糖合酶在麥芽糖和海藻糖之間的轉糖苷作用是一個可逆的過程，但大部分都傾向于海藻糖的生成反應。海藻糖合酶除了具有分子內(nèi)轉糖苷作用外，也有微弱的水解活性［8-11］。常溫菌中的海藻糖合酶，最適反應溫度為25～35℃，最適pH為6.5～8.0，由于該條件適用于多種微生物生長，因此采用常溫酶制備海藻糖時易受到雜菌污染，影響初始pH使得反應條件難以控制，消耗反應底物和產(chǎn)物造成原料浪費等。嗜熱菌來源的海藻糖合酶最適溫度為65℃，80℃下保溫60 min，在pH 5.5～9.5的范圍內(nèi)酶活力仍然保持穩(wěn)定［12］，便于提高酶反應溫度來抑制雜菌生長，減少污染。作者對實驗室前期構建的含有嗜熱棲熱菌海藻糖合酶基因的重組大腸桿菌進行了發(fā)酵工藝優(yōu)化，并嘗試了高溫處理破碎E.coli細胞以釋放海藻糖合酶，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1菌株

含嗜熱棲熱菌海藻糖合酶基因的重組大腸桿菌E.coli BL21（DE3）/pET24a（+）-TreS為作者所在實驗室保藏。

1.2主要儀器

LS-B50L型立式圓形壓力蒸氣滅菌器：上海醫(yī)用核子儀器廠；空氣恒溫搖床：上海精密儀器儀表有限公司；Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)：美國Agilent公司；DYY-6C型核酸電泳儀：北京六一電泳儀廠：pH計：Mettler-Toledo公司；超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海醫(yī)療器械研究所；DKB-600A型電熱恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：Bio-Rad公司；INFORS 3 L全自動發(fā)酵罐：伊孚森生物技術有限公司；30 L全自動發(fā)酵罐：NBS公司。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，卡那霉素0.1；pH 7.0。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)基

1）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：（NH4）2HPO44.0，KH2PO413.5，C6H8O7·H2O 1.7，MgSO4·7H2O 1.4，蛋白胨 1.0，酵母粉2.0，甘油8；微量元素液10mL/L。

2）微量元素液（g/L）：FeSO4·7H2O 10.0，ZnSO4·7H2O 2.3，CuSO4·5H2O 1.0，MnSO4·4H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O 0.2，CaCl22.0，（NH4）6Mo7O240.1。

3）補料培養(yǎng)基（g/L）：甘油 600.0，MgSO49.0，蛋白胨2.4，酵母粉4.8。

1.4培養(yǎng)方法

1.4.1種子培養(yǎng)從-80℃保藏的甘油管中接種100μL菌液于種子培養(yǎng)基中 （50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶），于37℃、200 r/min回轉式搖床培養(yǎng)8 h。

1.4.23L發(fā)酵罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液以10%的接種體積分數(shù)接入3 L全自動發(fā)酵罐INFORS中，裝液量1.2 L。初始通氣量為1.5 L/min，攪拌轉速300～800 r/min，通過調節(jié)轉速控制溶氧30%，培養(yǎng)溫度37℃，用氨水控制pH 7.0。溶氧水平維持在30%，當溶氧迅速反彈（甘油快消耗完）時，開始以指數(shù)流加方式補加補料液。當OD600為50時，開始恒速流加乳糖進行誘導。

1.5分析方法

1.5.1細胞光密度菌液稀釋后于波長600 nm處進行比色，用去離子水為對照，測定菌濃。

OD600=讀數(shù)×稀釋倍數(shù)

1.5.2胞內(nèi)酶液的獲取收集發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min后，將菌體沉淀用20 mmol/L、pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液重新懸浮，混勻。用超聲波細胞粉碎機破碎懸浮液中菌體的細胞壁（超聲細胞破碎儀的工作條件：φ6工作探頭，時間10 min，工作3 s停3 s，功率為20%），然后12 000 r/min離心10min，離心后上清液即為發(fā)酵胞內(nèi)粗酶液。

1.5.3海藻糖合酶酶活力測定取400μL稀釋適當倍數(shù)的粗酶液，加入400μL用20mmol/L、pH 7.0磷酸緩沖液配制的10 g/dL麥芽糖溶液，混合溶液60℃反應30min，然后沸水浴10min終止酶反應，用HPLC測定生成的海藻糖含量。

HPLC檢測條件為：流動相（乙腈∶水=80∶20），流速：0.8 mL/min， 柱溫：40℃，NH2柱（APS-2 HYPERSIL，Thermo Scientific），示差折光檢測器。

酶活單位定義：在上述反應條件下，每分鐘形成1μmol海藻糖所需的酶量定義為1個酶活力單位。

1.5.4SDS-PAGE電泳取1 mL OD600為5的菌體發(fā)酵液，12 000 r/min離心2min，去上清液，沉淀用去離子水洗滌兩遍，再離心，沉淀用pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液懸浮，超聲處理10 min，離心后沉淀為包涵體，上清液為可溶性蛋白質。包涵體用20μL上樣緩沖液溶解，于沸水浴中5 min，離心，海藻糖合酶包涵體存在于上層上樣緩沖液中，包涵體的上樣量為3μL。取20μL上清液，加入5μL上樣緩沖液混勻，于沸水浴中5min，離心，上樣量為8μL。

1.5.5加熱處理菌懸液方法于75、80、85℃3個溫度下將菌懸液加熱振蕩處理0.5 h，離心后測定上清液殘留酶活。

2　結果與討論

2.13L罐發(fā)酵工藝優(yōu)化

作者采用實驗室前期構建的重組菌，首先進行3 L發(fā)酵罐產(chǎn)酶優(yōu)化，繼而用所獲最優(yōu)條件進行30 L發(fā)酵罐初步放大。作者采用分批補料發(fā)酵，以指數(shù)流加進行補料，在發(fā)酵過程中補加充足的營養(yǎng)物質，以達到重組菌的高密度發(fā)酵，最終實現(xiàn)重組酶的高效表達。

2.1.1誘導溫度對重組菌生長以及產(chǎn)酶的影響誘導溫度是重組大腸桿菌產(chǎn)外源蛋白質的關鍵因素。溫度對菌生長以及產(chǎn)酶的影響較大。在較高的誘導溫度時，蛋白質合成較快，常常由于不能及時正確折疊形成包涵體。在較低的誘導溫度時，可降低無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而減少包涵體的形成。溫度降低重組大腸桿菌生長速度降低，并且其蛋白質表達水平也將隨之低［14］。作者在誘導劑乳糖補加速率為0.2 g/（L·h）的條件下，分別嘗試了25、32、37℃為誘導溫度，考察了其對菌體生長和產(chǎn)酶的影響。

由圖1可知，不同的誘導溫度對重組菌生長的影響并不明顯，達到穩(wěn)定期時菌體濃度只有些微的差別。當誘導溫度為25℃和37℃時能夠達到的最高菌體濃度相近，在32℃誘導下所得的菌濃OD600最高，達到213，為25℃和37℃誘導下的1.2倍。然而，菌體的產(chǎn)酶狀況與生物量的多少并不呈正比。菌體在32℃誘導下所得酶活最高，為472 U/mL，分別是25℃和37℃誘導時酶產(chǎn)量的2.3倍和1.5倍。因此，發(fā)酵重組大腸桿菌生產(chǎn)海藻糖合酶時應采用32℃的誘導溫度。

圖1　誘導溫度對重組大腸桿菌生長和產(chǎn)酶的影響Fig.1　Effects of inducing tem perature on E.coli grow th and production of trehalose synthase

從圖2可知，細胞破碎上清液和沉淀的SDSPAGE分析可知，誘導溫度為32℃時，可溶性蛋白質表達量最多，說明這個誘導溫度最佳。誘導溫度為25℃時，電泳圖中的海藻糖合酶的可溶性蛋白質條帶不明顯，并且包涵體的條帶也比較細，可能是由于誘導溫度較低，使得重組大腸桿菌的蛋白質表達水平低。當誘導溫度為37℃時，海藻糖合酶的可溶性蛋白質條帶比誘導溫度為32℃時細，但是包涵體的條帶比較粗，可能由于誘導溫度過高使得基因表達過快而導致蛋白質折疊易發(fā)生錯誤，或者蛋白質聚集的速度過快形成致密的不可溶包涵體，降低了重組大腸桿菌可溶性蛋白質的表達。

圖2　誘導溫度對產(chǎn)酶影響的SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of the effects of inducing temperature on production of trehalose synthase

2.1.2補加乳糖的速率對重組菌生長以及產(chǎn)酶的影響T7啟動子表達系統(tǒng)中，需要添加乳糖來誘導蛋白質的表達。乳糖是一種溫和型的誘導劑，無毒，價廉。通常情況下，高強度誘導不利于重組大腸桿菌的高密度生長和產(chǎn)酶［15］，為了緩解乳糖誘導對菌體造成的傷害并降低工業(yè)化生產(chǎn)中誘導劑的成本問題，作者比較了誘導溫度為32℃的情況下，不同乳糖誘導濃度對大腸桿菌生長以及產(chǎn)海藻糖合酶的影響。實驗中乳糖采用流加方式進行誘導，當OD600達到50時，乳糖通過3種不同的速率補加，分別為0.1、0.2、0.4 g/（L·h）。

由圖3可知，補加乳糖的速率對重組大腸桿菌生長的影響較小，但對產(chǎn)酶的影響較大。當乳糖補加速率為0.2 g/（L·h）時，重組大腸桿菌的生長情況最好，OD600能達到213，分別是乳糖補加速率0.1 g/（L·h）和0.4 g/（L·h）下的1.1倍和1.2倍。當乳糖補加速率為0.1 g/（L·h）時，產(chǎn)酶速率最低，并且最終酶活僅有141 U/mL，可能由于0.1 g/（L·h）誘導強度不夠導致了重組大腸桿菌蛋白質表達水平較低。當提高乳糖補加速率至0.2 g/（L·h）和0.4 g/（L·h）時，發(fā)酵過程中產(chǎn)酶速率明顯提高，并且乳糖補加速率為0.2 g/（L·h）時的產(chǎn)酶量最高，達到472 U/mL，分別是乳糖補加速率0.4 g/（L·h）和0.1 g/（L·h）下的1.4倍和3.3倍。所以乳糖補加速率應選擇0.2 g/（L·h）。

由圖4細胞破碎上清液和沉淀的SDS-PAGE分析可知，乳糖補加速率為0.2 g/（L·h）的時候，可溶性表達蛋白質最多，與上述酶活情況一致。當誘導濃度為0.4 g/（L·h）時形成了大量的包涵體，可能由于誘導劑量較大使得蛋白折疊速度過快并且大量聚集形成的，導致海藻糖合酶可溶性蛋白質表達水平降低。

圖3　乳糖補加速率對重組大腸桿菌生長和產(chǎn)酶的影響Fig.3　Effects of lactose feeding rate on E.coli grow th and production of trehalose synthase

圖4　乳糖補加速率對產(chǎn)酶影響的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of the effects of lactose feeding rate on production of trehalose synthase

2.230 L發(fā)酵罐初步放大

要實現(xiàn)重組酶的工業(yè)化生產(chǎn)，必須進行發(fā)酵規(guī)模放大研究。自20世紀中期以來，發(fā)酵罐的比擬放大，主要采用的是一種在解決主要矛盾的基礎上，協(xié)調解決放大后可能被激化的次要矛盾的方法，即經(jīng)驗法［13］。因此采用3 L發(fā)酵罐最優(yōu)發(fā)酵條件進行30 L發(fā)酵罐初步放大試驗來研究重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的效果。如圖5所示，隨著發(fā)酵的進行，菌濃和胞內(nèi)酶活逐漸升高，當發(fā)酵39 h時，菌濃OD600達到 126.9，海藻糖合成酶酶活也達到最高，為356.2 U/mL。在30 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵過程中不通純氧，為了滿足菌體對溶氧的需求，攪拌轉速最高提升到900 r/min，通氣量最大時升至55 L/min，罐壓最高時提至0.08 MPa。發(fā)酵16 h后，按3 L發(fā)酵罐條件指數(shù)流加補料，其溶氧無法維持在30%，所以調控甘油補加速率約為3 L發(fā)酵罐的50%以維持溶氧水平，由此導致30 L發(fā)酵罐的重組菌生長周期較長且菌濃較低，但并不影響重組大腸菌可溶性蛋白質的表達水平。結果表明，30 L發(fā)酵罐達到的最高菌濃OD600是 3 L發(fā)酵罐的60%，每單位OD的酶活為3 L發(fā)酵罐的1.2倍。

圖5　30 L發(fā)酵罐生產(chǎn)海藻糖合酶的發(fā)酵過程曲線Fig.5　Fermentation　process curve of the trehalose synthase by 30 L fermentation tank

2.3加熱處理菌懸液釋放胞內(nèi)海藻糖合酶

由于海藻糖合酶在E.col i BL21（DE3）宿主菌中為胞內(nèi)表達，需要細胞破碎提取。高溫處理發(fā)酵菌懸液可破壞菌體細胞釋放細胞內(nèi)的海藻糖合酶。溫度越高對于細胞膜的破壞越有利，但溫度過高容易導致海藻糖合酶因熱變性而失去酶活，所以需要選擇一個合適的溫度。以高壓勻漿法破碎細胞所得酶活計為100%。如圖6所示，80℃水浴處理30 min時相對酶活最高，為72.3%。

圖6　加熱處理后的相對酶活Fig.6　Relative enzyme activity after heat treatment

3　結語

近年來，我國在海藻糖的基礎理論和應用方面的研究較多，但海藻糖工業(yè)生產(chǎn)方面涉及較少。作者對E.coli BL21（DE3）/pET24a（+）-TreS基因工程菌在3 L發(fā)酵罐進行了發(fā)酵工藝優(yōu)化，發(fā)酵35 h時酶活達到472 U/mL，是優(yōu)化前的2.3倍，并且是搖瓶的12倍左右，進而采用該條件在30 L發(fā)酵罐進行了初步放大研究，發(fā)酵39 h，酶活達到356U/mL。與陳穎等［17］10 L罐高密度發(fā)酵的酶活3.197 U/mL相比，酶活是其100倍以上。由于該海藻糖合酶熱穩(wěn)定性好，因此嘗試了高溫處理破碎E.coli細胞以釋放海藻糖合酶。結果表明，80℃處理30min，海藻糖合酶的得率可達72.3%，簡化了海藻糖生產(chǎn)程序，為海藻糖合酶用于海藻糖的工業(yè)化提供了依據(jù)。

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會議信息

會議名稱（中文）：第二屆抗菌科學與技術論壇

開始日期：2016-10-27結束日期：2016-10-28

所在城市：江蘇省蘇州市

具體地點：西交利物浦國際會議中心

主辦單位：全國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)企業(yè)管理協(xié)會抗菌產(chǎn)業(yè)分會西安交通大學蘇州納米科學與工程技術學院 西安交通大學蘇州研究院

全文截稿日期：2016-09-10

聯(lián)系電話：010-82543499/62521791

傳真：010-82543499

E-MAIL：ciaa2001@126.com

會議網(wǎng)站：http://ciaa.kjj.com.cn/2016/xiehuidongtai_0307/2838.html

會議背景介紹：抗菌科學與技術論壇是全國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)企業(yè)管理協(xié)會抗菌產(chǎn)業(yè)分會主辦的學術大會，兩年一屆。大會堅持以“推動抗菌學術研究，促進抗菌學科發(fā)展”為宗旨，致力于為國內(nèi)外從事抗菌相關科學研究高校、科研院所的專家、學者、科技工作者，政府有關部門及領導，企業(yè)技術人員、工程師，搭建一個開放式的專業(yè)學術交流平臺，以達到共同提高目的，并提高抗菌技術在我國國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中的地位和作用。第二屆抗菌科學與技術論壇由全國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)企業(yè)管理協(xié)會抗菌產(chǎn)業(yè)分會和西安交通大學蘇州納米科學與工程技術學院聯(lián)合主辦，將于2016年10月27日-28日在江蘇省蘇州市召開。大會將開展包括大會邀請報告、專題報告、快速報告（口頭報告）、墻報交流、匯編交流等多種形式的學術交流。目前，論文征集活動已經(jīng)啟動，歡迎從事抗菌相關研究的科研人員、技術人員和在校學生踴躍投稿并積極參會。

Optim ization of Trehalose Synthase Fermentation Conditions from Recombinant Escherichia coli

ZHANG Yue1，2，SU Lingqia1，2，WU Jing*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to achieve efficient production of the trehalose synthase from Thermus thermophilus，the optim ization of fermentation conditions was investigated in E.coli BL21（DE3）harboring the plasm id pET24a（+）-TreS.The optim ized fermentation conditionswere as follows：the inducing temperature is32℃，theadding rateof lactose is0.2 g/（L·h）When OD600reached 50.Under the condition，the enzyme activity reached 472 U/m L at cultivation of 35 h，was 2.3 times than before.In addition，the fermentation was performed in 30 L bioreactor under the condition of preceding narrative，the enzyme activity reached 356 U/m L.Because the thermal stability of trehalose synthase is good，E.coli cellwas broken up through high temperature.The results showed that treated it 30m in under 80℃the yield of trehalose synthase reached 72.3%.It have industrial application prospect.

trehalosesynthase，high-efficiencyexpression，geneticallyengineeredbacterium，fermentor，high-temperature processing

TQ 920.1

A

1673—1689（2016）09—0913—07

2015-01-19

國家自然科學基金杰出青年基金項目（31425020）。

吳敬（1969—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品與發(fā)酵工程方面的研究。E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn