林大專 惠 春 孫全樂 殷 玥

（長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林 長春 130031）

HPLC法測定賴氨酸磷酸氫鈣顆粒中鹽酸賴氨酸的含量

林大專 惠 春 孫全樂 殷 玥

（長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林 長春 130031）

目的 建立高效液相色譜柱前衍生化法測定賴氨酸磷酸氫鈣顆粒中鹽酸賴氨酸的含量。方法 采用鄰苯二醛（OPA）為衍生化試劑進行柱前衍生化，色譜柱為Kromasil5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%三乙醇胺（48∶52）；檢測波長為326 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃。結果 鹽酸賴氨酸在78.6～1100.4 μg范圍內線性良好，相關系數γ=0.9995（n=5），平均回收率為100.2%，（RSD=1.59%，n=6）。結論 該方法簡單、快速，可作為賴氨酸磷酸氫鈣顆粒的質量控制方法。

HPLC法；賴氨酸磷酸氫鈣顆粒；鹽酸賴氨酸；鄰苯二醛柱前衍生化

賴氨酸磷酸氫鈣顆粒是由鹽酸賴氨酸和磷酸氫鈣組成的復方制劑，具有促進幼兒正常生長發(fā)育，補充兒童及孕婦鈣質的作用。其中鹽酸賴氨酸為主要生理活性成分，鹽酸賴氨酸本身不產生熒光，且無紫外吸收［1］，通常采用與茚三酮反應比色法測定含量，該法的專屬性與穩(wěn)定性均較差，為該藥品的質量控制帶來了一定的困難。本文采用鄰苯二醛衍生化試劑進行柱前衍生化，利用HPLC法對賴氨酸磷酸氫鈣顆粒中鹽酸賴氨酸進行含量測定，為該制劑的質量控制提供有效、可行的方法。

1　儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀［Agilent 1200可變波長檢測器（VWD），Agilent 1200數據站， G1354A四元梯度泵及G1316A柱溫箱系美國Agilent公司產品］；L-賴氨酸鹽酸鹽對照品（南通飛宇生物科技有限公司，含量98%以上）；鄰苯二醛（上海亞太精細化工公司出品，化學純）；賴氨酸磷酸氫鈣顆粒（批號為120601，120602，120603，白求恩醫(yī)科大學制藥廠）；甲醇為色譜純，三乙醇胺，三乙胺，乙醇均為分析純，水為超純化水。

2　方法與結果

2.1溶液制備。0.15%鄰苯二醛（OPA）溶液的配制：精密稱取鄰苯二醛0.1523 g，用少量甲醇溶解，用水定容至100 mL量瓶中，搖勻即得。

對照品溶液的配制：精密稱取鹽酸賴氨酸對照品0.0795 g，用少量水溶解，用70%堿性乙醇（用三乙胺調pH至10.7［2］）定容至50 mL容量瓶中，搖勻，得對照品溶液。

樣品溶液的配制：精密稱取樣品（每批）約125 mg，用1 mL水溶解，用70%堿性乙醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

2.2色譜條件。色譜柱：Kromasil5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%三乙醇胺（48∶52）；檢測波長：326 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：20 ℃。

2.3方法學考察。線性試驗：精密量取鹽酸賴氨酸對照品溶液0.05，0.10，0.30，0.50，0.70 mL于反應管中，加水稀釋至1 mL，分別加入0.15%OPA溶液2 mL，密塞后搖勻管內液體，將反應管置于沸水浴中加熱1 min［2］，立即冷卻至室溫，進樣20 μL至液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以鹽酸賴氨酸衍生物的峰面積為縱坐標（A），質量為橫坐標（m），進行線性回歸，回歸方程：A=9.6993m-93.021，相關系數r=0.9995（n=5），結果表明鹽酸賴氨酸在78.6～1100.4 μg范圍內色譜峰面積與質量之間具有良好的線性關系。

精密度試驗：精密量取對照品溶液0.5 mL于反應管中，照線性試驗同法操作，連續(xù)進樣5次，結果顯示鹽酸賴氨酸衍生物峰面積的RSD分別為1.67%（n=5），表明本法精密度良好。

重現性試驗：取批號為120601的樣品，照樣品溶液配制的方法制備樣品溶液，精密量取續(xù)濾液1.0 mL至反應管中，照線性試驗同法操作，注入液相色譜儀，測定峰面積。重復操作6次，結果顯示鹽酸賴氨酸衍生物峰面積RSD為1.91%，表明本方法重現性良好。

穩(wěn)定性試驗：取批號為120601的樣品，照樣品溶液配制的方法制備樣品溶液，分別于0、3、6 h時精密量取續(xù)濾液1.0 mL至反應管中，照線性試驗同法操作，測定峰面積。結果顯示RSD為1.61%，表明樣品溶液在6 h內基本穩(wěn)定。

加樣回收率試驗：精密稱取批號為120601的樣品0.1251 g，照樣品溶液配制方法制備樣品溶液，精密量取該樣品溶液6份，每份0.5 mL，于反應管中，加入對照品溶液各0.2 mL，加水0.3 mL，照線性試驗測定方法測定峰面積，計算回收率，結果鹽酸賴氨酸的平均回收率為100.2%，RSD=1.59%（n=6）；結果見表1。

表1　鹽酸賴氨酸加樣回收率試驗結果

2.4樣品含量測定：依法操作，測得3批樣品中鹽酸賴氨酸標示量百分含量分別為97.0%（1.28%），98.1%（0.56%），95.0%（0.63%），括號中為每個樣品3次測定結果的相對標準偏差。

3　討 論

采用70%乙醇溶解樣品，可以防止在溫度較高時，賴氨酸受細菌作用變質，導致其濃度發(fā)生變化。本方法為OPA與賴氨酸柱前衍生化法，反應的最佳條件是沸水浴1 min，溫度較低OPA與賴氨酸衍生化反應比較緩慢，反應時間過長會導致衍生化產物分解，因此HPLC法測定應在15 min內完成。本法專屬性強，回收率好，樣品處理簡單，因此該法可用于賴氨酸磷酸氫鈣顆粒的質量控制。

［1］成丹，李健和，彭詞艷，等.高效液相色譜法和非水電位滴定法測定注射用鹽酸賴氨酸含量的比較［J］.中國藥業(yè)，2012，21（15）：51-53.

［2］凌笑梅，劉養(yǎng)清，杜鳴，等.高效液相色譜-紫外檢測法測定賴氨酸注射液中賴氨酸含量［J］.沈陽藥科大學學報，2000，17（5）：349-352.

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1671-8194（2016）27-0021-01