白伶俐 蘆笛 高霞

【摘要】目的：觀察水通道蛋白9（AQP9）在子癇前期患者胎盤、胎膜組織中的定位、mRNA及表達變化，分析AQP9在子癇前期發(fā)病中發(fā)揮的作用。方法：選取本院2014年3月至2015年5月收治的100例孕婦作為研究對象，其中有50例為正常晚期妊娠孕婦，將這50例作為對照組；另外50例為子癇前期孕婦（孕周38～42周），輕度子癇前期孕婦與重度子癇前期孕婦各25例，將這50例子癇前期患者作為觀察組。利用免疫組織化學增強聚合物法對AQP9的定位情況進行測定；利用逆轉錄-聚合酶鏈反應對AQP9 mRNA進行檢測；利用蛋白印跡技術對蛋白的表達水平進行檢測；通過使用凝膠蛋白定量分析軟件對蛋白灰度值進行測定。結果：（1）AQP9在羊膜上皮細胞、絨毛膜滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞上定位；（2）兩組患者的胎膜組織和胎盤中都有AQP9 mRNA表達；（3）觀察組胎膜組織、胎膜中AQP9的灰度值都要高于對照組，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而且觀察組中重度子癇前期患者胎膜組織、胎膜中AQP9的灰度值要高于輕度子癇前期患者，對比差異，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：子癇前期患者AQP9的表達水平得到較大程度的提升，AQP9是造成子癇前期發(fā)病的主要因素。

【關鍵詞】子癇前期；胎盤；胎膜組織；AQP9；表達變化

Expression of aquaporin-9 in placenta and fetal membrane of preeclampsia patientsBAI Lingli， LU Di， GAO Xia. Department of Obstetrics， Hospital Affiliated to Yanan University， Yanan 716000， Shaanxi， China

【Abstract】Objectives： To observe changes in the location， mRNA and expression of aquaporin-9 （AQP9） in placenta and fetal membrane of preeclampsia patients， to analyze its role in the pathogenesis of preeclampsia. Methods： 100 pregnant women treated in our hospital from March 2014 to May 2015 were selected including 50 normal third trimester pregnant women as control group and 50 preeclampsia patients （gestational age of 38 to 42 weeks） as observation group， i.e. 25 mild preeclampsia pregnant women and 25 severe ones. Immunohistochemical reinforced polymer was used to determine the location of AQP9， reverse transcription-polymerase chain reaction to test the 9 mRNA， protein imprinting technology to test the protein expression levels， and the gel protein quantitative analysis software for determination of protein grey value. Results： Firstly， the AQP9 was located in amniotic epithelial cells， human chorionic trophocyte and sertoli cells. Secondly， expression of AQP9 was found in the membranes and placenta of both groups. Thirdly， the AQP9 grey value on placenta and fetal membrane in the observation group was higher than the control group， with statistically significant difference （P<0.05）， and the AQP9 grey value on placenta and fetal membrane in patients with severe preeclampsia was also higher than those with mild preeclampsia， with statistically significant difference （P<0.05）. Conclusions： Expression level of AQP9 in patients with preeclampsia increases， indicating AQP9 is the main factor of preeclampsia.

【Key words】Preeclampsia； Placenta； Foetal sac； Aquaporin-9 （AQP9）； Changes in expression

【中圖分類號】R714.4【文獻標志碼】A

孕婦在妊娠期間普遍會患上妊娠期高血壓疾病，而子癇前期是最常見的類型之一，同時也是造成孕產(chǎn)婦死亡的主要原因[1]。目前，子癇前期發(fā)病機制仍然處于不清晰的狀態(tài)，專家認為早期形成胎盤時，滋養(yǎng)細胞沒有深入入侵子宮內(nèi)膜，重鑄子宮螺旋小動脈出現(xiàn)障礙，從而使胎盤出現(xiàn)“淺著床”現(xiàn)象，這些因素促使子癇前期的發(fā)作[2]。細胞分化及遷移過程中，水通道蛋白9（AQP9）會對其產(chǎn)生一定的影響，其表達升高在一定程度上加快了細胞凋亡的速度，細胞的遷移能力逐漸下降，細胞分化和細胞融合也會受到相應抑制作用，導致胎盤出現(xiàn)缺血缺氧現(xiàn)象，由此推斷子癇前期發(fā)病很有可能與AQP9異常表達有一定的關系。選取2014年3月至2015年5月收治的100例孕產(chǎn)婦，作為子癇前期患者胎盤、胎膜組織中AQP9的表達變化與子癇前期發(fā)病的關系的研究對象，其結果如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取都是我院2014年3月至2015年5月收治的剖宮產(chǎn)患者，納入標準：（1）所有入選患者經(jīng)B型超聲檢查均符合子癇前期的診斷標準[3]；（2）患者簽訂知情同意書。排除標準：（1）患有心、腦、腎、肝等嚴重性疾病患者；（2）患者為過敏體質(zhì)，對藥物過敏；（3）患者患有精神類疾病或正在參加其他臨床試驗；（4）未按醫(yī)囑用藥，導致影響最終療效判斷的患者。將其分為對照組和觀察組，各50例。患者年齡為21～36歲，平均年齡為（24.53±4.34）歲，孕周為38～42周。其中50例正常足月妊娠產(chǎn)婦為對照組，25例輕度子癇前期孕婦和25例重度子癇前期產(chǎn)婦為觀察組。兩組產(chǎn)婦在年齡、孕周等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。子癇前期發(fā)病的診斷標準參考《婦產(chǎn)科學》中相關內(nèi)容。兩組患者都沒有患上糖尿病、腎炎、肝炎等合并癥，而且兩組病人也沒有出現(xiàn)妊娠期糖尿病、羊水量異常以及胎膜早破等并發(fā)癥。對照組患者由于瘢痕子宮、胎位不正等各種因素需要實施剖宮產(chǎn)術，觀察組患者除了子癇前期外，沒有產(chǎn)生其它并發(fā)癥，因瘢痕子宮、胎位不正或者病情需要實施剖宮產(chǎn)手術。

1.2方法

1.2.1采集標本對兩組患者均實施剖宮產(chǎn)手術，胎盤娩出之后，醫(yī)師立即在中央無鈣化區(qū)域取出半徑為1.5cm及體積為8cm3的胎盤組織各3份，將取出物置于常溫0.9%氯化鈉液體中，將血液清洗干凈后，將其分成3份，將其中的1份放入標本袋中，并在標本袋中加入10%中性福爾馬林，固定1d之后將其送入病理科，經(jīng)24h石蠟包埋的碳膜組織及胎盤，主要是用作免疫組化研究。將剩下的2份放入凍存管中，對凍存管進行編號，然后將凍存管放入液氮中進行冷卻，最后將其保存在-80℃的低溫冰箱中，可在Western-blothing實驗和RT-PCR實驗中使用[3]。

1.2.2免疫組織化學增強聚合物法用石蠟包埋固定的胎膜組織和胎盤，對其進行切片處理，厚度為3μm，將其進行脫蠟復水處理之后，放入EDTA中，讓其進行修復。在濃度為30%的過氧化氫溶液中添加甲醇，直至將其稀釋成濃度為0.9%的溶液，將胎膜組織和胎盤放入稀釋后的溶液10min，這樣就能將內(nèi)源性過氧化物酶清除干凈；然后將其封閉在5%BSA中，時間維持15min；再向其中加入經(jīng)稀釋液處理過的一抗（稀釋比例為1：2000），并且保持4℃的溫度，放置1晚；二抗用過氧化物酶進行標記，羊抗兔比例為1∶100，在室溫下孵育時長為40min，用二氨基聯(lián)苯胺對其進行顯色，用蘇木素復染[4]。將肝臟細胞當作陽性對照，若細胞膜或細胞質(zhì)上能清晰地見到棕黃色或者黃色顆粒，則該細胞即為陽性細胞。

1.2.3逆轉錄-聚合酶鏈反應利用TRIzol將胎膜組織和胎盤中所有的RNA抽提出來，用分光光度計對260nm和280nm兩處位置的吸光度值進行測定，將總RNA的純度和濃度計算出來，需要注意的是OD260與OD280的比值必須大于1.8，將5lRNA逆轉錄成cDNA[5]。

1.2.4Western-blothing實驗剪碎組織，嚴格遵照相關文獻標準進行，在一抗中應用兩組患者胎膜組織和胎盤AQP9多克隆抗體，其比例為1：500，在二抗中采用經(jīng)過氧化物酶標記處理的羊抗兔IgG，其比例為1：5000[6]。應用凝膠灰度分析軟件Quantitry One4.6.2來檢測底片，測量其灰度值，同時對AQP9標本和β-actin的灰度值進行檢測，AQP9的相對含量就是AQP9灰度值與β-actin灰度值的比值。

1.3統(tǒng)計學的方法

匯總處理兩組患者的臨床數(shù)據(jù)后，應用統(tǒng)計學軟件SPSS16.0對其進行處理，其中用χ2來檢驗組間率對比，用率（%）來表示計數(shù)資料；若P>0.05，那么差異不具備統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩組產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤中AQP9定位情況

對照組和觀察組產(chǎn)婦的胎膜組織及胎盤中都能見到AQP9陽性表達細胞，具體定位于絨毛膜滋養(yǎng)細胞、羊膜上皮細胞以及胎盤合體滋養(yǎng)細胞。見圖1、圖2。

2.2兩組產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤中AQP9mRNA定性表達

在對照組和觀察組產(chǎn)婦的胎膜組織和胎盤中都檢測到了AQP9 mRNA表達，兩組患者的胎膜組織和胎盤標本中都擴增出β-actin，實際擴增片段是77bp，而且都能夠測出AQP9 mRNA表達，其中AQP9擴增的片段是78bp，和預期的長度一致。

2.3兩組產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤AQP9水平

2.3.1兩組產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤AQP9表達情況AQP9分子量約為27kda，β-actin分子量大約是43kda。在對照組和觀察組產(chǎn)婦胎膜組織及胎盤中都檢測到了AQP9。見圖3。

圖1AQP9在胎膜組織中的表達圖2AQP9在胎盤中的表達 圖3AQP9在胎膜組織和胎盤中的表達結果2.3.2兩組產(chǎn)婦AQP9的灰度值對照組產(chǎn)婦胎膜組織、胎盤中AQP9的灰度值分別為（0.17±0.02）、（0.20±0.02），觀察組產(chǎn)婦胎膜組織、胎盤中AQP9的灰度值分別為（0.54±0.16）、（0.54±0.14）。對比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3.3觀察組中輕度子癇前期與重度子癇前期患者胎膜組織和胎盤AQP9的灰度值25例輕度子癇前期患者胎膜組織和胎盤中的蛋白灰度值分別為（0.39±0.17）、（0.42±0.02），25例重度子癇前期患者胎膜組織和胎盤中的蛋白灰度值分別為（0.68±0.02）、（0.67±0.03），對比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3討論

3.1AQP9結構、生物學特性及能量代謝

AQP9是一種跨膜糖蛋白，是組成水通道蛋白的重要部分，其cDNA中中共包括2890個核苷酸分子，5個內(nèi)含子和6個外顯子共同組成了AQP9基因，該蛋白一級結構是由跨膜6次的單肽鏈組成，同源四聚體構成了其高級結構。AQP9對水通透性較好，而且其還能夠通透各種小分子，具體包括甘油、尿素、嘧啶和嘌呤，尤其甘油作用較為突出。AQP9是肝臟特異性蛋白，能夠在人體內(nèi)運輸甘油。Yoshiki等[5]對爪蟾卵母細胞表達進行研究后，了解到當溫度保持在25℃時，AQP9攝取的甘油會達到飽和狀態(tài)，而且其會隨溫度的變化而發(fā)生改變，當溫度在4～25℃范圍內(nèi)時，AQP9攝取的甘油量就會降低70%。Yamamoton[6]的研究結果表明，AQP9的表達水平會嚴重受到血胰島素濃度的影響，AQP9表達水平在糖尿病患者中會增加，認為AQP9與腦能量代謝有著密切的聯(lián)系。

3.2AQP9與子癇前期

3.2.1子癇前期發(fā)病與滋養(yǎng)細胞的關系子癇是威脅孕產(chǎn)婦健康甚至生命的四大疾病之一，一般發(fā)生在妊娠晚期或產(chǎn)后不久，發(fā)生在產(chǎn)前最為常見，被稱為產(chǎn)前子癇。子宮螺旋動脈重塑出現(xiàn)障礙與滋養(yǎng)細胞浸潤不足有著較大的聯(lián)系，其是子癇前期發(fā)病的主要因素。Arima等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，正常足月妊娠產(chǎn)婦合體滋養(yǎng)細胞的凋亡率明顯要低于足月妊娠重度子癇前期患者，子癇前期患者由于胎盤滋養(yǎng)細胞的侵襲能力不足，導致絨毛缺氧，與妊娠期高血壓疾病關系密切。在本研究中，最終結果表明AQP9在絨毛膜滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞中均有表達，且表達程度在子癇前期患者胎盤、胎膜組織中增強，說明AQP9可能與子癇前期發(fā)病存在一定的關系。

3.2.2AQP9與子癇前期的關系全部凋亡細胞在最初會發(fā)生形態(tài)學改變，造成水大量確實，繼發(fā)性細胞體積不斷縮小，此過程被專家稱為凋亡體積縮小。

在AVD時期，AQP9在水穿細胞膜運動中起著至關重要作用。正常孕婦胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞總的凋亡率顯著低于子癇前期孕婦。在該研究中，AQP9在子癇前期產(chǎn)婦胎膜組織和胎盤中的表達顯著高于對照組產(chǎn)婦，在觀察組患者中輕度子癇前期產(chǎn)婦要低于重度子癇前期產(chǎn)婦，而AQP9參與滋養(yǎng)細胞凋亡，這表明AQP9很有可能會加劇滋養(yǎng)細胞的凋亡，使胎盤出現(xiàn)缺氧缺血現(xiàn)象。

Wang等[8]通過體外培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)水通道蛋白促進了水分子滲透細胞運動，其在細胞遷移中發(fā)揮著重要的作用。Carbrey等[9]的實驗結果顯示，滋養(yǎng)細胞與破骨細胞有著相似的分化過程，即能夠形成多核結構，具體是分裂活躍而沒有分化的細胞滋養(yǎng)細胞，經(jīng)過融合與分化之后產(chǎn)生的。Fujita等[10，11]發(fā)現(xiàn)，AQP9會對破骨細胞分化產(chǎn)生一定的影響，而單核細胞經(jīng)過融合之后形成了破骨細胞，認為AQP9參與了滋養(yǎng)細胞的分化過程。

Joblonski等[12]通過試驗，發(fā)現(xiàn)AQP9在正常妊娠病人胎盤組織中的表達較子癇前期患者明顯降低，認為AQP9的異常表達對滋養(yǎng)細胞分化、遷移和凋亡產(chǎn)生了巨大的影響，其參與了子癇前期發(fā)病過程[13]。本研究表明，觀察組胎膜組織、胎盤的AQP9表達明顯要高于對照組患者，輕度子癇前期患者要低于重度患者，此結果與Badaut[14]相關研究具有一致性，表明AQP9增強是導致子癇前期發(fā)病的主要原因。

參考文獻

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