康興嬌，賈招閃，申紅妙，焦文哲，冉隆賢，2*，甄志先*

1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北保定071001

2.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定071000

內(nèi)生枯草芽孢桿菌CN181發(fā)酵條件優(yōu)化

康興嬌1，賈招閃1，申紅妙1，焦文哲1，冉隆賢1，2*，甄志先1*

1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北保定071001

2.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定071000

為了提高枯草芽孢桿菌CN181菌株在發(fā)酵液中的數(shù)量，本試驗(yàn)通過(guò)采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌CN181的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化和篩選。通過(guò)單因子試驗(yàn)得出，玉米粉為最適碳源，豆粕為最適氮源，K+和Na+為最適金屬離子；正交試驗(yàn)法得到了發(fā)酵液中各組分的最佳含量，分別是：玉米粉15.0 g·L-1、豆粕10.0 g·L-1、K2HPO42.0 g·L-1和NaCl 2.0 g·L-1；在確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的含量后，對(duì)CN181菌株的最適培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，其最佳條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值8.0、250 mL搖瓶裝液量30 mL、接種量2%（體積分?jǐn)?shù)）、培養(yǎng)溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r·min-1、培養(yǎng)時(shí)間24 h。

枯草芽孢桿菌；內(nèi)生細(xì)菌；發(fā)酵條件

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CN181是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理實(shí)驗(yàn)室從小麥感病品種5389的實(shí)生組培苗中分離得到的一株內(nèi)生細(xì)菌［1］，它不僅對(duì)小麥葉銹病和桉樹(shù)青枯病有很好的防治效果［1，2］，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)葡萄霜霉病也有防治效果［3］，具有很好的生防開(kāi)發(fā)潛力。目前生產(chǎn)上對(duì)葡萄霜霉病的防治多以化學(xué)藥劑為主，但化學(xué)藥劑所產(chǎn)生的副作用是不可逆的［4］。自1921年Hartele［5］利用真菌防治猝倒病開(kāi)啟了以菌治菌的歷史以來(lái)，植物病害生防微生物已涉及真菌、放線菌、細(xì)菌和病毒（噬菌體）等種群［5］。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，芽孢桿菌類因其所具有的生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、極易分離培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)［6-9］，已被越來(lái)越多的植病研究者用于防治植物病害［7-11］。

發(fā)酵是生防菌進(jìn)行推廣應(yīng)用的前提［9，12］。影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中細(xì)菌數(shù)量的因素除了遺傳特性外，主要有培養(yǎng)基的成分和發(fā)酵條件［8，12，13］。玉米粉、葡萄糖、豆餅粉、魚粉及其它一些微量元素是生產(chǎn)上培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的主要原料。調(diào)整培養(yǎng)基中各組分的配比，可以改善枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)條件，提高發(fā)酵液中的含菌量。因此，本試驗(yàn)通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選，得出其最適發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，為該菌株的工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試菌株

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）CN181，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基（NA）［14］。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基原料：碳源是蔗糖、玉米粉、可溶性淀粉和麥麩；氮源是黃豆粉、豆粕、魚粉和硝酸鉀；金屬離子是MgSO4·7H2O、K2HPO4、Ca（NO3）2和NaCl。

1.3培養(yǎng)基組分的篩選與優(yōu)化

種子培養(yǎng)液：用牙簽挑取于NA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h的CN181菌株的單菌落，接種于NA液體培養(yǎng)基中，于200 r·min-1、28℃條件下培養(yǎng)8～10 h，即為種子培養(yǎng)液。

最佳碳源的篩選［15］：碳源含量為15.0 g·L-1，將上述提到的4種碳源替換液體種子培養(yǎng)基中的葡萄糖，對(duì)照培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為7.0，搖瓶的裝液量為60 mL/250 mL，0.1 MPa、121℃滅菌30 min。接種量為0.6 mL（2%）的CN181菌株的種子培養(yǎng)液，于200 r·min-1、28℃條件下培養(yǎng)28 h。

2.3 對(duì)信息脫貧的長(zhǎng)期性認(rèn)識(shí)不足 現(xiàn)有的研究對(duì)信息貧困的長(zhǎng)期性認(rèn)識(shí)不足，從給出信息貧困成因的相應(yīng)對(duì)策中，解決區(qū)域性的經(jīng)濟(jì)貧困，只能說(shuō)改善了當(dāng)?shù)匦畔⒇毨顩r。在解決信息貧困的對(duì)策中，政策制定有一定的儲(chǔ)備期，政策的落實(shí)有相當(dāng)長(zhǎng)的滯后期；信息貧困人群信息意識(shí)的培育也有一定周期；信息環(huán)境的改善和信息技術(shù)的普及也不是一蹴而就的，所以從諸多影響信息貧困的因素來(lái)理解，信息富集與信息貧困總是相對(duì)的，信息貧困人口總是會(huì)客觀存在，并會(huì)長(zhǎng)期存在。

最佳氮源的篩選［15］：氮源含量為15.0 g·L-1，將上述提到的4種氮源替換液體種子培養(yǎng)基中的蛋白胨、酵母浸膏和牛肉浸膏，對(duì)照培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基。其他條件同上。

金屬離子的篩選［15］：以篩選后的碳源、氮源為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2.0 g·L-1的MgSO4·7H2O、K2HPO4、Ca（NO3）2和NaCl，對(duì)照為不加金屬離子的培養(yǎng)基。其他條件同上。

培養(yǎng)基各組分配比的優(yōu)化：通過(guò)上述試驗(yàn)得到的碳源-玉米粉、氮源-豆粕及無(wú)機(jī)鹽-K2HPO4和NaCl進(jìn)行4因素5水平的正交試驗(yàn)，采用L25（56）正交設(shè)計(jì)確定各組分的最佳配比。選擇的因素及水平見(jiàn)表1。

表1　培養(yǎng)基成分的正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels of the orthogonal test for components of culture medium

1.4最佳培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.4.1培養(yǎng)基初始pH值、接種量和裝液量的優(yōu)化培養(yǎng)基初始pH值：用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)優(yōu)化培養(yǎng)基pH值為6.5、7.0、7.5和8.0，其他條件同1.3。

裝液量：搖瓶的裝液量為30 mL/250 mL、60 mL/250 mL、90 mL/250 mL和120 mL/250 mL，其他條件同1.3。

接種量：將接種量按1%、2%、5%和10%的體積分?jǐn)?shù)接種在配好的培養(yǎng)基中，其他條件同1.3。

根據(jù)上述3個(gè)因素進(jìn)行3因素4水平的正交試驗(yàn)，采用L16（45）正交設(shè)計(jì)確定各發(fā)酵條件的水平。

1.4.3發(fā)酵轉(zhuǎn)速的優(yōu)化在上述培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵轉(zhuǎn)速的優(yōu)化，將該菌株分別放在150 r·min-1、180 r·min-1、210 r·min-1和240 r·min-1條件下培養(yǎng)，其他條件同1.3。

1.4.4最適發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化在上述條件優(yōu)化之后，以優(yōu)化的最佳配比與培養(yǎng)條件為發(fā)酵參數(shù)，繪制該菌的生長(zhǎng)曲線。自接菌開(kāi)始，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h、28 h和32 h時(shí)分別取樣測(cè)定搖瓶發(fā)酵液的光密度（OD600值）［16］，同時(shí)用平板菌落計(jì)數(shù)法［17］測(cè)定發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD多重比較，正交試驗(yàn)結(jié)果采用正交試驗(yàn)的直觀分析法。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基組分對(duì)枯草芽孢桿菌CN181菌株生長(zhǎng)的影響

2.1.1不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌CN181菌株生長(zhǎng)的影響由圖1可見(jiàn)，從發(fā)酵液中CN181菌株的數(shù)量來(lái)看，當(dāng)玉米粉作為碳源時(shí)，發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量最多，可達(dá)11.803×109CFU·mL-1；當(dāng)可溶性淀粉作為碳源時(shí)，發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量較多，可達(dá)10.685×109CFU·mL-1；而以其他原料作為碳源時(shí)，細(xì)菌數(shù)量從大到小依次為蔗糖＞對(duì)照＞麥麩。綜合分析，玉米粉作為碳源時(shí)，發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量最多，而且生產(chǎn)成本低廉，因此，選擇玉米粉作為枯草芽孢桿菌CN181菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。2.1.2不同氮源對(duì)枯草芽孢桿菌CN181菌株生長(zhǎng)的影響由圖2可見(jiàn)，從發(fā)酵液中CN181菌株的數(shù)量來(lái)看，當(dāng)豆粕作為氮源時(shí)，發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量最多，可達(dá)6.854×109CFU·mL-1；當(dāng)NA培養(yǎng)基中的牛肉浸膏、蛋白胨和酵母浸膏同時(shí)作為氮源時(shí)，發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量較多，可達(dá)5.846×109CFU·mL-1；而以其他原料作為氮源時(shí)，發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量從大到小依次為魚粉＞黃豆粉＞硝酸鉀。綜合分析，比較豆粕及NA培養(yǎng)基中的氮源對(duì)發(fā)酵液中CN181菌株的數(shù)量影響，二者不存在顯著差異，但以豆粕為氮源的發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量較多，而且豆粕的生產(chǎn)成本低廉，因此選擇豆粕作為枯草芽孢桿菌CN181菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖1　不同碳源對(duì)菌株CN181發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the fermentation of CN181 strain

圖2　不同氮源對(duì)菌株CN181發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of CN181 strain

圖3　不同金屬離子對(duì)菌株CN181發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of different metal ions on the fermentation of CN181 strain

2.1.3不同金屬離子對(duì)枯草芽孢桿菌CN181菌株生長(zhǎng)的影響由圖3可見(jiàn)，從發(fā)酵液中CN181菌株的數(shù)量來(lái)看，K+和Na+都能促進(jìn)菌株繁殖，菌株在含這兩種金屬離子的培養(yǎng)基中的數(shù)量顯著高于含其他金屬離子培養(yǎng)基中的數(shù)量；Ca2+對(duì)CN181菌株的繁殖影響不明顯；Mg2+、Mn2+和Fe2+則對(duì)CN181菌株的繁殖有強(qiáng)烈的抑制作用。由于K+、Na+的生產(chǎn)成本相當(dāng)，且K2HPO4有提高培養(yǎng)基pH值的作用，因此，選擇K2HPO4、NaCl作為枯草芽孢桿菌CN181菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的復(fù)合無(wú)機(jī)鹽。

2.2正交試驗(yàn)法優(yōu)化培養(yǎng)基各組分的配比

發(fā)酵培養(yǎng)基中4種成分配比正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　培養(yǎng)基各組分配比優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test for every proportion of medium

由表2可知，在正交試驗(yàn)中，各因素極差的大小反映了發(fā)酵培養(yǎng)基中4種成分對(duì)CN181菌株繁殖的影響，極差越大，影響越顯著。玉米粉、豆粕、K2HPO4和NaCl各水平的極差分別為3.194、3.662、0.841和1.740，因此，這4種成分對(duì)CN181菌株發(fā)酵的影響因素依次為：豆粕＞玉米粉＞NaCl＞K2HPO4。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米粉的含量為15.0 g·L-1時(shí)，細(xì)菌數(shù)量最多（6.606×109CFU·mL-1），隨著玉米粉含量的降低或升高，發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量均會(huì)降低；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕的含量為10.0 g·L-1時(shí)，細(xì)菌數(shù)量最多（7.209×109CFU·mL-1），隨著豆粕含量的增加，細(xì)菌數(shù)量則降低；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中K2HPO4的含量為2.0 g·L-1時(shí)，細(xì)菌數(shù)量最多（6.023×109CFU·mL-1），發(fā)酵培養(yǎng)基中K2HPO4的含量低于2.0 g·L-1時(shí)，細(xì)菌數(shù)量就會(huì)降低，高于2.0 g·L-1時(shí)，也會(huì)降低；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl的含量為2.0 g·L-1時(shí)，細(xì)菌數(shù)量達(dá)最大值6.331×109CFU·mL-1，且變化趨勢(shì)同K2HPO4。結(jié)果表明，該菌株最適生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組分配比為：玉米粉15.0 g·L-1、豆粕10.0 g·L-1、K2HPO42.0 g·L-1及NaCl 2.0 g·L-1。

2.3正交試驗(yàn)法對(duì)枯草芽孢桿菌CN181發(fā)酵條件的優(yōu)化

影響枯草芽孢桿菌CN181發(fā)酵的3個(gè)條件的正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test for optimal culture conditions

由表3可知，在正交試驗(yàn)中，各優(yōu)化條件極差的大小反映了這3個(gè)條件對(duì)CN181菌株繁殖影響的主次，極差越大，影響越顯著。初始pH值、裝液量和接種量各水平的極差分別為3.619、6.789和2.181，因此，這3個(gè)條件對(duì)CN181菌株發(fā)酵影響的主次因素依次為：裝液量＞初始pH值＞接種量。在所測(cè)pH值范圍內(nèi)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值是8.0時(shí)，細(xì)菌數(shù)量最多，為8.778×109CFU·mL-1，初始pH值降低，則細(xì)菌數(shù)量減少；當(dāng)250 mL三角瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基的量為30 mL時(shí)，細(xì)菌數(shù)量達(dá)最大值11.658×109CFU·mL-1，隨著裝液量的增加，細(xì)菌數(shù)量的繁殖就會(huì)減少；當(dāng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為2%時(shí)，細(xì)菌數(shù)量最多，為8.211×109CFU·mL-1，高于2%的接種量，發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量反而不會(huì)增加，接種量減小，同樣也不利于該菌株的繁殖。由此表明，最適該菌株繁殖的發(fā)酵條件是：初始pH值8.0、裝液量30 mL/250 mL三角瓶和接種量2%。

2.4搖床發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

2.4.1培養(yǎng)溫度的優(yōu)化不同培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌CN181菌株繁殖的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，在所測(cè)溫度范圍內(nèi)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量最多，為13.093×109CFU·mL-1，培養(yǎng)溫度高于30℃或低于30℃，發(fā)酵液中細(xì)菌數(shù)量均會(huì)減少。通過(guò)數(shù)據(jù)分析得出，發(fā)酵液中該菌株的數(shù)量在30℃和其余3個(gè)溫度培養(yǎng)時(shí)在0.01水平上均具有極顯著差異。因此，CN181菌株發(fā)酵的最適溫度為30℃。

2.4.2搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌CN181菌株繁殖的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，在所測(cè)搖床轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1、210 r·min-1和240 r·min-1時(shí)，發(fā)酵液中的細(xì)菌數(shù)量均較多，分別為13.338×109CFU·mL-1、14.408×109CFU·mL-1和12.684×109CFU·mL-1，僅150 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液中菌株的細(xì)菌數(shù)量較少。通過(guò)數(shù)據(jù)分析得出，搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1、210 r·min-1和240 r·min-1時(shí)，發(fā)酵液中細(xì)菌數(shù)量在0.01水平上不存在極顯著差異，而與150 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)時(shí)在0.01水平上均存在極顯著差異。因此，從菌量生長(zhǎng)及節(jié)約能源的角度綜合考慮，CN181菌株發(fā)酵的最適搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。

圖4　不同溫度對(duì)菌株CN181發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of different temperatures on the fermentation of CN181 strain

圖5　不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株CN181發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of different rotation speed on the fermentation of CN181 strain

2.5最適發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌CN181菌株培養(yǎng)時(shí)間的測(cè)定，繪制了該菌株在玉米粉豆粕培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。通過(guò)圖6可知，CN181菌株在搖瓶發(fā)酵時(shí)，初期NA培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)量大于玉米粉豆粕培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)量，在16 h時(shí)，兩種培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)量接近一致，16 h后，玉米粉豆粕培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)量繼續(xù)增加，直至24 h時(shí)生長(zhǎng)至最大值8.858×109CFU·mL-1，隨后開(kāi)始下降，進(jìn)入衰亡期；而NA培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)量在16 h時(shí)已達(dá)最大值5.995×109CFU·mL-1，之后開(kāi)始下降，進(jìn)入衰亡期。綜合發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵液中CN181菌株的繁殖數(shù)量來(lái)看，玉米粉豆粕培養(yǎng)基更適合枯草芽孢桿菌CN181菌株的生長(zhǎng)，且最佳培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

圖6　菌株CN181在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.6 The growth curve of CN181 strain in two media

3　結(jié)論與討論

培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件對(duì)枯草芽孢桿菌CN181菌株的生長(zhǎng)繁殖有重要影響，為了提高CN181菌株的產(chǎn)菌量，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，初步得到了搖瓶條件下枯草芽孢桿菌CN181菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方為：玉米粉15.0 g·L-1、豆粕10.0 g·L-1、NaCl 2.0 g·L-1、K2HPO42.0 g·L-1；最適發(fā)酵條件為：初始pH值8.0、250 mL搖瓶裝液量30 mL、接種量2%、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r·min-1、培養(yǎng)時(shí)間24 h。

研究結(jié)果表明，優(yōu)化培養(yǎng)基中的碳源玉米粉和氮源豆粕與大多數(shù)研究者對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源的研究結(jié)果一致，但在玉米粉和豆粕的用量上有所不同［12，15，18］，這表明：不同枯草芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵液中C/N的要求不同。CN181菌株更適合在C/N較大的環(huán)境中繁殖。研究還發(fā)現(xiàn)，CN181菌株生長(zhǎng)的最適金屬離子為Na+和K+，這與前人的研究存在一定差異，王佳佳等［8］的研究?jī)H選用了Na+；丁翠珍等［19］的研究表明，雖然Na+和K+都是其優(yōu)化出的最佳金屬離子，但其所選用的無(wú)機(jī)鹽是KNO3，這與本研究中的K2HPO4有所不同；趙斌等［9］的研究則選用了KH2PO4和CaCl2等金屬離子；劉雪等［20］的研究雖然選用了K2HPO4中的K+做為最適金屬離子之一，但其還選用了Fe2+和Mg2+等金屬離子作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的復(fù)合金屬離子，這表明：不同枯草芽孢桿菌對(duì)無(wú)機(jī)鹽的需求有所不同；然而，章四平等［15］、張麗霞等［12，18］和李小俊等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，CaCO3在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵中是必不可少的無(wú)機(jī)鹽類，張麗霞等還認(rèn)為CaCO3對(duì)芽孢桿菌芽孢的形成及發(fā)酵液pH值的調(diào)節(jié)有重要作用。然而發(fā)酵條件對(duì)枯草芽孢桿菌繁殖的影響因不同菌株而異，通過(guò)與前人的研究相比發(fā)現(xiàn)：不同的菌株對(duì)pH值的要求差異較大，但多數(shù)菌株喜中性或偏堿的環(huán)境［8，9，12，16，19］，少數(shù)菌株喜偏酸的環(huán)境［15，21］；枯草芽孢桿菌多喜歡通氣良好的環(huán)境；枯草芽孢桿菌對(duì)溫度的要求多為28℃～32℃［8，9，12，15，19-21］，轉(zhuǎn)速多為200 r·min-1左右［12，15，19，20］，對(duì)這兩個(gè)條件的要求并無(wú)顯著差異；而在培養(yǎng)時(shí)間的研究中發(fā)現(xiàn)，不同菌株對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的要求存在顯著差異，本研究的最佳培養(yǎng)時(shí)間為24 h，這與李小俊等［16］的研究一致，且在前人研究的最佳培養(yǎng)時(shí)間16 h～72 h范圍內(nèi)［8，15，16，19，21］。

本試驗(yàn)只是在搖瓶條件下對(duì)枯草芽孢桿菌CN181菌株的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了初步探索，而對(duì)于該菌株的產(chǎn)芽孢量及其在發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)（如抗菌蛋白或酶的活性及產(chǎn)量等），以及在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)和實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)發(fā)酵條件的控制方面尚待進(jìn)一步探索，這將為該菌株的生防作用及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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Optimizationof Fermentation ConditionsforEndophyticBacillus subtilisCN181

KANG Xing-jiao1，JIA Zhao-shan1，SHEN Hong-miao1，JIAO Wen-zhe1，RAN Long-xian1，2*，ZHEN Zhi-xian1*
1.College of Forestry/Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China
2.Hebei Key Lab of Forest Germplasm Resources and Protection，Baoding 071000，China

To increase the population density of Bacillus subtilis CN181 in the broth，fermentation media and fermentation conditions of B.subtilis CN181 were screened and optimized by single factor and orthogonal tests in this study.The results from single factor experiment showed that the optimum carbon，nitrogen sources and metal ions were corn flour，soybean dregs，K+and Na+.The best medium was composed of corn flour at 15.0 g·L-1，soybean dregs at 10.0 g·L-1，K2HPO4at 2.0 g·L-1，and NaCl at 2.0 g·L-1based on the orthogonal test.Finally，the culture conditions were optimized as the following：the initial pH of the fermentation medium at 8.0，the liquid medium volume at 30 mL in a 250 mL flask，the inoculation volume at 2%（v/v），the fermentation temperature at 30℃，the rotation speed at 180 r·min-1and the fermentation time for 24 h.

Bacillus subtilis；endophytic bacteria；fermentation conditions

S852.61+6

A

1000-2324（2016）05-0647-07

2016-03-07

2016-06-06

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)：果樹(shù)霜霉病防控技術(shù)研究與示范（201203035）

康興嬌（1988-），女，河北省石家莊人，在讀碩士生，主要從事林木病理學(xué)研究.E-mail：956293374@qq.com

Author for correspondence.E-mail：zhenzhixian@hebau.edu.cn；longxianran@163.com