潘寶龍，馬潤(rùn)玫

（昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650031）

妊娠期糖尿病大網(wǎng)膜前脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)及增殖分化模型的建立*

潘寶龍，馬潤(rùn)玫

（昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650031）

目的建立妊娠期糖尿?。℅DM）大網(wǎng)膜前脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)及向成熟脂肪細(xì)胞增殖分化的模型，為脂肪細(xì)胞體外研究奠定基礎(chǔ)。方法使用改良的細(xì)胞培養(yǎng)法，以GDM剖宮產(chǎn)患者大網(wǎng)膜純脂肪組織為原材料，作前脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代，繪制傳代前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，并對(duì)傳代前脂肪細(xì)胞做誘導(dǎo)分化，對(duì)已誘導(dǎo)分化細(xì)胞通過(guò)油紅O染色和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)脂聯(lián)素mR NA，并進(jìn)行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果培養(yǎng)出的前脂肪細(xì)胞基本均為梭形細(xì)胞，增殖旺盛，第4天細(xì)胞開(kāi)始快速增殖，倍增時(shí)間約為48h。第7天原代前脂肪細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)脂肪顆粒，而傳代細(xì)胞仍然保持梭形和無(wú)脂滴。傳代前脂肪細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)，出現(xiàn)定向分化，經(jīng)油紅O脂肪染色和脂聯(lián)素mR NA測(cè)定，證明已誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞。結(jié)論GDM大網(wǎng)膜脂肪組織中具有前脂肪細(xì)胞，可進(jìn)行連續(xù)傳代和大量擴(kuò)增。原代前脂肪細(xì)胞在培養(yǎng)增殖過(guò)程中，會(huì)自然出現(xiàn)向成熟脂肪細(xì)胞分化，而傳代后前脂肪細(xì)胞則失去分化能力，經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)后可定向分化為成熟脂肪細(xì)胞。模型的建立，可為后續(xù)脂肪細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究做好前期準(zhǔn)備。

前脂肪細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞模型

脂肪組織是一個(gè)功能強(qiáng)大的內(nèi)分泌器官，可分泌瘦素、脂聯(lián)素等脂肪因子，其可能對(duì)胰島素抵抗、心血管功能、糖脂代謝、系統(tǒng)炎癥及骨代謝起調(diào)節(jié)作用[1-3]。目前，學(xué)術(shù)界對(duì)脂肪因子展開(kāi)的生物學(xué)研究的體外實(shí)驗(yàn)載體基本采用嚙齒類動(dòng)物脂肪細(xì)胞[4-6]。不可忽視的一個(gè)影響因素是，嚙齒類動(dòng)物與人類存在明顯的遺傳學(xué)差異，兩者的代謝途徑也截然不同。因此，將其作為實(shí)驗(yàn)載體往往難以避免潛在的實(shí)驗(yàn)缺陷問(wèn)題，從而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)論的科學(xué)性。相對(duì)而言，人源前脂肪細(xì)胞是人體中一種特異化的前體細(xì)胞，具有增殖能力和向成熟脂肪細(xì)胞定向分化的能力，在人的一生中均存在并持續(xù)作用，且與糖尿病、肥胖、動(dòng)脈硬化等代謝類疾病關(guān)系密切[7]。以人源細(xì)胞作為研究載體，更具科學(xué)性，并且以取自相應(yīng)疾病患者網(wǎng)膜組織而培養(yǎng)傳代的前脂肪細(xì)胞，可能更多地保留該疾病其他的基因信息，更真實(shí)地模擬疾病的基因環(huán)境，使結(jié)果更具有說(shuō)服力。本研究在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)體外脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)方法做一定程度的改良，嘗試建立妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）患者大網(wǎng)膜前脂肪細(xì)胞體外原代培養(yǎng)及增殖分化模型，以期為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1前脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前，遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定報(bào)批，并取得患者知情同意。取GDM剖宮產(chǎn)患者大網(wǎng)膜相對(duì)純凈脂肪組織10～20g，去除可見(jiàn)血管及纖維成分，pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，剪成盡可能小的碎糊狀。按照1∶2體積比加入Ⅰ型膠原酶溶液（2mg/ml），5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，37℃消化3 h，1 000 r/min離心10 min。棄上清液和漂浮的脂肪細(xì)胞，37℃紅細(xì)胞裂解液處理沉淀細(xì)胞5～10min，分別以100和200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾。1000r/min離心10min，棄上清，將沉淀細(xì)胞加入前脂肪細(xì)胞基本培養(yǎng)基[杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）]，輕輕吹打懸浮細(xì)胞，調(diào)配細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/cm3，接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。觀察細(xì)胞貼壁后立即進(jìn)行培養(yǎng)基更換，并除去未貼壁細(xì)胞。每日監(jiān)測(cè)，每3天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。

1.2前脂肪細(xì)胞的傳代

待細(xì)胞生長(zhǎng)至單層融合接近80%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞傳代。實(shí)驗(yàn)前用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)，并提前開(kāi)啟紫外燈靜態(tài)殺菌30min。棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2次，棄PBS液，加入2 ml胰酶37℃進(jìn)行消化，待細(xì)胞稍微變圓后，立即將培養(yǎng)瓶豎起使胰酶與細(xì)胞分離，棄瓶中胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基，并將瓶壁上的細(xì)胞吸管反復(fù)吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/cm3，分別接種至75 cm2培養(yǎng)皿6和24孔板中。每3天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。當(dāng)傳代細(xì)胞生長(zhǎng)至單層融合接近80%時(shí)，可再次進(jìn)行，往下傳代。

1.3繪制傳代前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

使用1個(gè)24孔板作為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)板，每2孔為1組，將24孔隨機(jī)分成12組，每天檢測(cè)1組，計(jì)數(shù)2孔各自細(xì)胞總數(shù)，取平均值，以此類推，連續(xù)計(jì)數(shù)12d，至12組結(jié)束，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4傳代前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

待傳代細(xì)胞生長(zhǎng)至單層融合接近80%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)分化。將培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基（制備方法見(jiàn)附表），5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，更換培養(yǎng)基為含10μg/ml胰島素的基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)基更換為基本培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪顆粒的數(shù)量和速度?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需求繼續(xù)或停止培養(yǎng)。

1.5油紅O染色

吸棄孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞3次，每孔分別加入10%甲醛磷酸鹽緩沖溶液1.5ml，在常溫下固定20 min，吸棄固定液，PBS沖洗細(xì)胞3次，60%異丙醇沖洗1次，37℃干燥5 min，每孔加入油紅O染液1.5 ml，室溫染色2 h，雙蒸水反復(fù)沖洗將油紅洗去，37℃干燥5min，置顯微鏡下觀察和拍照。

附表　分化培養(yǎng)基配制

1.6前脂肪細(xì)胞、成熟脂肪細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)脂聯(lián)素mRNA

1.6.1R NA提取使用美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑抽提，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，以日本UV-2450紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所抽提RNA含量和純度。

1.6.2聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳脂聯(lián)素mRNA引物序列：正向引物：5'-ATCGGTGAAACCGGAGTACC-3'，反向引物：5'-GCATGTTGGGGATAGTAACGTAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度148bp，體系為25μl。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下判讀，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.7細(xì)胞凍存

培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞經(jīng)消化和吹打制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 ml冷凍液保存（DMEM∶胎牛血清∶二甲基亞砜=8∶1∶1）吹打混勻后移入凍存管，封口，4℃放置40 min，置入-20℃冰箱冷凍2 h，再置入-80℃冰箱冷凍保存，如短期內(nèi)不使用則移入液氮（-196℃）中保存。

1.8細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮中取出冷凍管，迅速投到37℃水中，并不斷搖動(dòng)（使管中的液體迅速融化），待完全溶解后取出，75%酒精擦拭凍存管外壁，超凈工作臺(tái)內(nèi)取出管內(nèi)液體，1000r/min離心10min，棄上清液，加入37℃、10 ml基本培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度為1×105個(gè)/ml，分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后更換為新鮮培養(yǎng)基，每日監(jiān)測(cè)，每3天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶的80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞

培養(yǎng)6 h即可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，13 h細(xì)胞貼壁率70%，24 h后基本全部貼壁，細(xì)胞呈不規(guī)則形，較為分散，數(shù)目較少。第3天觀察基本變?yōu)樗笮渭?xì)胞，少數(shù)呈多角形，細(xì)胞數(shù)目也有所增加。第4天細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入快速增殖，第7天原代前脂肪細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變，逐漸由梭形變橢圓或圓形，胞內(nèi)可見(jiàn)脂肪顆粒，而傳代后細(xì)胞形態(tài)仍然保持梭形，局部可出現(xiàn)單層融合，細(xì)胞排列較為緊密。第9天發(fā)現(xiàn)原代前脂肪細(xì)胞內(nèi)含有大量脂肪顆粒，說(shuō)明大量原代細(xì)胞已自行分化為成熟脂肪細(xì)胞。而傳代細(xì)胞至第9天后仍繼續(xù)保持梭形，細(xì)胞基本單層融合，排列緊密，油紅O染色仍未著色。見(jiàn)圖1～3。

圖1　原代前脂肪細(xì)胞第3天（油紅O染色×100）

圖2　原代前脂肪細(xì)胞第4天（油紅O染色×100）

圖3　原代前脂肪細(xì)胞第9天（油紅O染色×100）

2.2傳代培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞

傳代后前脂肪細(xì)胞前4 d細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況與原代前脂肪細(xì)胞極為相似，基本為梭形，大小較為均勻。5～6d后細(xì)胞進(jìn)入快速增殖，排列平行緊密。通常第7天即可完成單層融合，光鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)無(wú)反光小滴，說(shuō)明無(wú)脂肪顆粒產(chǎn)生，即便培養(yǎng)9 d后油紅O染色仍未著色（見(jiàn)圖4）。其連續(xù)傳代可大量擴(kuò)增，但發(fā)現(xiàn)傳代到5代后，增殖和分化率開(kāi)始降低。

圖4　傳代前脂肪細(xì)胞第9天（油紅O染色×100）

2.3前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

以第2代傳代細(xì)胞為監(jiān)測(cè)對(duì)象，使用1個(gè)24孔板作為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)板，每天隨機(jī)計(jì)數(shù)2孔細(xì)胞，取平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)12d。見(jiàn)圖5。

圖5　前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.4第3代傳代前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

第3代傳代細(xì)胞誘導(dǎo)后，出現(xiàn)向成熟脂肪細(xì)胞的定向分化。第6天即可見(jiàn)部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)單個(gè)散在反光小滴。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸增多，第12天可見(jiàn)胞內(nèi)已聚集大量脂滴，經(jīng)油紅O染色初步證實(shí)分化成功。見(jiàn)圖6、7。

圖6　分化第6天（油紅O染色×400）

圖7　分化第12天（油紅O染色×400）

2.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

前脂肪細(xì)胞無(wú)脂聯(lián)素mRNA表達(dá)，成熟脂肪細(xì)胞有脂聯(lián)素mRNA表達(dá)。見(jiàn)圖8。

圖8　逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

3 討論

在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，脂肪組織僅被認(rèn)為是人體儲(chǔ)存脂質(zhì)的場(chǎng)所，在人體能量不足的情況下，受刺激而釋放能量。直到上世紀(jì)90年代，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)脂肪瘦素的存在，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)脂肪的認(rèn)知才得以改變。脂肪組織不但可以作為人體能量的儲(chǔ)存“庫(kù)房”，同時(shí)其自身也具有活躍的內(nèi)分泌功能，包括脂肪因子等，在人體能量穩(wěn)態(tài)及調(diào)控糖、脂代謝平衡的維持中，發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，針對(duì)脂肪因子的研究越來(lái)越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注[8-10]，因涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原因，許多研究只能是局限于人體血清學(xué)和體內(nèi)組織學(xué)的表象研究，而進(jìn)一步更深層次的研究，如對(duì)于基因表達(dá)（過(guò)表達(dá)或沉默）與疾病的關(guān)系研究，只能以體外實(shí)驗(yàn)方式進(jìn)行，常見(jiàn)的是細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型。體外前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)，對(duì)于研究脂肪細(xì)胞、脂肪因子、相應(yīng)細(xì)胞因子等與相關(guān)疾病的關(guān)系，具有重要的作用。同時(shí)，作為理想的脂肪細(xì)胞研究模型，有利于觀察各種相關(guān)因素在脂肪組織發(fā)生、增殖及肥大整個(gè)演變過(guò)程中的調(diào)控作用，有助于對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入研究。

近年來(lái)，隨著對(duì)人體脂肪組織大量研究工作的開(kāi)展，對(duì)前脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法、分離獲取能力也提出更高的要求。學(xué)者們的培養(yǎng)方法不盡一致，各操作者自身的經(jīng)驗(yàn)不一，實(shí)驗(yàn)室的條件也不盡相同，因而得出的結(jié)果和經(jīng)驗(yàn)也各具特點(diǎn)[11-13]。對(duì)于人源前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)，目前采用較多的是血管基質(zhì)組分細(xì)胞培養(yǎng)法，操作較為簡(jiǎn)便，但最大的缺點(diǎn)是細(xì)胞的增殖和分化速度較慢，培養(yǎng)基中雜質(zhì)較多，并且容易出現(xiàn)細(xì)胞大小不均，導(dǎo)致后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易受到影響[12-13]。GARCIA等[14]曾提出細(xì)胞島學(xué)說(shuō)，認(rèn)為細(xì)胞島存在于成熟脂肪組織中，島內(nèi)細(xì)胞均為前脂肪細(xì)胞，具有高增殖速度和高分化能力，是脂肪組織的發(fā)源地，對(duì)脂肪組織的增生和肥大起至關(guān)緊要的作用。本研究筆者基于上述學(xué)說(shuō)，總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，將天花板培養(yǎng)與脂肪組織塊貼壁的方法相結(jié)合，著重加強(qiáng)和改良消化方式，將多數(shù)文獻(xiàn)使用的消化方式（37℃、1 mg/mlⅠ型膠原酶，30～120 min）改良為按照1∶2體積比加入Ⅰ型膠原酶溶液（2 mg/ml），5%CO2培養(yǎng)箱，37℃消化3h，增加消化液使用量和濃度，延長(zhǎng)消化時(shí)間，并且使用紅細(xì)胞裂解液37℃處理沉淀細(xì)胞5～10min，以去除殘留紅細(xì)胞的污染，從而盡可能地達(dá)到較好地消化效果。實(shí)踐證明上述改良是較為成功的，所得到培養(yǎng)細(xì)胞成分均一，數(shù)量較多，增殖較為旺盛，可能延長(zhǎng)消化時(shí)間，更完全地消化成熟脂肪細(xì)胞，也更多地分離出細(xì)胞島中前脂肪細(xì)胞。

對(duì)于前脂肪細(xì)胞的判別標(biāo)準(zhǔn)，有學(xué)者提出必須滿足3個(gè)條件[15-16]：①細(xì)胞為經(jīng)典的梭形形態(tài)，脂肪組織來(lái)源，胞漿內(nèi)極少或無(wú)脂肪顆粒；②細(xì)胞增殖速度與同一個(gè)體的成纖維細(xì)胞類似，增倍時(shí)間短；③胰島素促進(jìn)下，細(xì)胞在單層融合后能形成成熟脂肪細(xì)胞，胞內(nèi)可見(jiàn)脂肪滴，或者能檢出特異性酶或脂聯(lián)素。本研究取材于剖宮產(chǎn)GDM患者大網(wǎng)膜組織，經(jīng)過(guò)消化、過(guò)濾、離心等系列處理后得到一些長(zhǎng)梭形細(xì)胞，光鏡下胞漿內(nèi)不見(jiàn)反光小滴，也不能被油紅O著色，培養(yǎng)之后細(xì)胞增殖快速，從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以看出，倍增時(shí)間約為48h，控制條件下可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后可出現(xiàn)分化，經(jīng)過(guò)油紅O染色，初步證實(shí)分化成功。脂聯(lián)素是目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)公認(rèn)的成熟脂肪細(xì)胞特有的細(xì)胞因子[17-19]，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)誘導(dǎo)分化前后的細(xì)胞進(jìn)行脂聯(lián)素mRNA表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞有脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)，而未經(jīng)誘導(dǎo)的傳代細(xì)胞未能檢測(cè)到脂聯(lián)素mRNA，從而證實(shí)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞為成熟脂肪細(xì)胞。而本實(shí)驗(yàn)從網(wǎng)膜組織中分離得到的細(xì)胞，上述3個(gè)條件，是人源原代前脂肪細(xì)胞。

值得一提的是，本實(shí)驗(yàn)中筆者在原代和傳代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，原代前脂肪細(xì)胞第7天開(kāi)始有部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，逐漸由梭形變橢圓乃至圓形，并且光鏡下胞內(nèi)可見(jiàn)脂肪顆粒，第9天發(fā)現(xiàn)原代前脂肪細(xì)胞內(nèi)含有大量脂肪顆粒，說(shuō)明大量原代細(xì)胞已自行分化為成熟脂肪細(xì)胞。而傳代后前脂肪細(xì)胞直至第12天仍繼續(xù)保持梭形，油紅O染色仍未著色，必須經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，才會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)多次重復(fù)培養(yǎng)，仍然出現(xiàn)該現(xiàn)象，證實(shí)GDM原代前脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中，會(huì)自然出現(xiàn)向成熟脂肪細(xì)胞分化，并不需要外加高濃度胰島素和地塞米松，而傳代后前脂肪細(xì)胞則出現(xiàn)失去分化的能力。原代前脂肪細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)自然分化，無(wú)法傳代，可能與該現(xiàn)象有關(guān)。而該現(xiàn)象的發(fā)生，可能與原代細(xì)胞來(lái)源于體內(nèi)成熟脂肪組織，在體內(nèi)可能已經(jīng)被激活，或者仍然會(huì)攜帶某些體內(nèi)分化因子，與外加的誘導(dǎo)劑作用相類似[20]。而傳代后前脂肪細(xì)胞出現(xiàn)失去分化的能力，可能是隨著不斷傳代，與人體內(nèi)環(huán)境比較，體外培養(yǎng)環(huán)境出現(xiàn)越來(lái)越大的偏差，導(dǎo)致傳代細(xì)胞發(fā)生一定程度生物學(xué)特性的變化，并且該變化隨傳代數(shù)增加而表現(xiàn)越發(fā)明顯，具體表現(xiàn)為增殖和分化能力的不斷下降。本研究結(jié)果也證實(shí)，通常傳代在5代以內(nèi)時(shí)，細(xì)胞的增殖及分化能力尚可，再往后傳代則增殖和分化率開(kāi)始降低。本實(shí)驗(yàn)后期所做細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)冷凍保存的細(xì)胞最佳選擇為傳代第2代或第3代細(xì)胞，并且只宜凍存復(fù)蘇1次。同樣涉及到細(xì)胞增殖和分化能力降低的問(wèn)題，也從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳八褂脙龃婧蛷?fù)蘇技術(shù)還存在一定的缺陷，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

綜上所述，GDM大網(wǎng)膜脂肪組織中具有前脂肪細(xì)胞，可進(jìn)行連續(xù)傳代和大量擴(kuò)增。經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)后可定向分化為成熟脂肪細(xì)胞。本課題組成功建立GDM患者大網(wǎng)膜前脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)及增殖的模型，為脂肪組織體外細(xì)胞學(xué)研究、脂肪因子體外表達(dá)研究、疾病發(fā)病機(jī)理等實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

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（童穎丹編輯）

Establishment of primary culture，proliferation and differentiation model of GDM preadipocytes*

Bao-long Pan，Run-mei Ma
（Kunming Medical University，Kunming，Yunnan 650031，China）

Objective To establish the model of primary culture，proliferation and differentiation of the gestational diabetes mellitus（GDM）epiploon preadipocytes，so as to lay the foundation for the follow-up study. Methods Using improved cell culture method，the pure fat tissue of greater omentum from GDM patients having cesarean section was used for the primary culture and passage.The growth curve of the preadipocytes was drawn.The adipocytes differentiated from preadipocytes after induction were determined by oil red O staining，and their adiponectin mRNA level was detected with RT-PCR to confirm the differentiation，and then the experimentsofcellcryopreservationandresuscitationwerecarriedout.ResultsTheprimarycultured preadipocytes were almost spindle cells with strong proliferation capacity.They began to proliferate rapidly on the 4th day，the doubling time was about 48 h.On the 7th day，the original generation of preadipocytes began to have fat particles，and the passage cells remained to be spindle without lipid drops.After induction，the passage preadipocytes showed oriented differentiation，oil red O staining and adiponectin mRNA measurement proved that the cells had differentiated into mature adipocytes.Conclusions Preadipocytes exit in GDM mature adipose tissue，can be continuously passaged and greatly amplified.In the culture progress，the original generation of preadipocytes will naturally differentiate into mature adipocytes，but the passaged preadipocyteslose the ability of differentiation，after appropriate induction，they can differentiate into mature fat cells. Keywords：preadipocyte；cell culture；cell model

R 714.255；R 589.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.003

1005-8982（2016）19-0011-06

2016-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81160082）

馬潤(rùn)玫，E-mail：pbl6916@163.com