伍玲園，黃華，莫似恩，陳自洪，阮秋燕，孫燕萍，乃東紅，牛向麗

（廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生計(jì)生委生殖中心生殖科，廣西 南寧 530021）

臨床報(bào)道

未見原核和單原核受精卵來源囊胚解凍移植的臨床研究*

伍玲園，黃華，莫似恩，陳自洪，阮秋燕，孫燕萍，乃東紅，牛向麗

（廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生計(jì)生委生殖中心生殖科，廣西 南寧 530021）

目的探討受精卵在觀察原核時(shí)期消失，以及部分消失單原核受精卵最終發(fā)育成囊胚的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選取2013年1月-2015年7月于該中心進(jìn)行體外受精-胚胎移植治療的19例患者，其中未見原核（0PN）而最終發(fā)育成囊胚進(jìn)行凍融移植患者17例，單原核受精卵（1PN）最終發(fā)育成囊胚進(jìn)行凍融移植患者2例，解凍后觀察胚胎的復(fù)蘇質(zhì)量，移植后對患者的臨床妊娠情況進(jìn)行隨訪。結(jié)果17例0PN來源囊胚的解凍移植周期中臨床妊娠6例，其中4例足月活產(chǎn)（3男1女），1例早停育，1例早期流產(chǎn)；解凍1PN囊胚的2例臨床隨訪結(jié)果陰性。結(jié)論0PN來源的囊胚解凍移植可獲得一定的臨床妊娠率，在無雙原核受精卵來源胚胎下，可作為正常胚胎移植。

未見原核；單原核受精卵；囊胚；解凍移植；妊娠

輔助生殖技術(shù)給廣大不孕夫婦帶來新的希望，從技術(shù)上解決不孕、不育等長期困擾醫(yī)學(xué)界的難題，糾正病理的生殖狀態(tài)，延續(xù)生殖過程。在體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）治療過程中，成熟卵母細(xì)胞完成第2次成熟分裂并與精子融合形成受精卵。目前，評估受精的方法主要是根據(jù)在適當(dāng)時(shí)機(jī)觀察第二極體的排出和原核情況。正常受精卵有2個(gè)原核（2 pronucleus，2PN），由于原核的不同步發(fā)育，使單一時(shí)間的觀察不完全準(zhǔn)確，這并不一定提示受精失敗[1]。繼續(xù)培養(yǎng)未見原核（non-pronuclcus，0PN）和單原核受精卵（onepronuclcus，1PN）受精卵可發(fā)生卵裂甚至發(fā)育成囊胚，這兩種來源的胚胎能否使用，一直困擾著胚胎學(xué)家們。本研究通過延長體外培養(yǎng)時(shí)間，篩選出發(fā)育潛能良好的囊胚，進(jìn)行玻璃化冷凍保存，對0PN和1PN來源的囊胚進(jìn)行解凍移植，隨訪其臨床妊娠結(jié)局并分析移植價(jià)值。

1 資料與方法

1.1研究對象

選取2013年1月-2015年7月于本中心行0PN和1PN來源囊胚凍融移植的患者，男性精液未見異常，來源為體外受精（in vitro fertilization，IVF）；其中解凍移植0PN來源囊胚17例，年齡24～45歲,平均（33.29±4.79）歲；不孕年限1～11年，平均（4.65± 3.04）年；原發(fā)不孕4例，繼發(fā)不孕13例；解凍移植1PN來源囊胚2例，年齡30～35歲，不孕年限3～5年，原發(fā)不孕1例，繼發(fā)不孕1例。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原核觀察和囊胚期胚胎評估原核的觀察通常是在常規(guī)IVF或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）授精后16～20h進(jìn)行，倒置顯微鏡下觀察原核的形態(tài)和數(shù)量。正常受精卵可觀察到2PN，只有1個(gè)原核的為1PN受精，未觀察到原核而發(fā)育成胚胎的為0PN，≥3個(gè)原核的為多PN受精。培養(yǎng)至第5或6天進(jìn)行囊胚評估，根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵化，將囊胚的發(fā)育分為1～6個(gè)時(shí)期，又根據(jù)3～6期囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量分為A、B、C 3級，3～6期囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞分為A、B、C 3級[2]；根據(jù)評級挑選適合冷凍或移植的囊胚，冷凍的囊胚解凍后進(jìn)行移植。

1.2.2囊胚的冷凍和復(fù)蘇本中心采用玻璃化冷凍方法，將可冷凍的囊胚置于玻璃化平衡液（equilibrium solution，ES）液滴12～15 min，隨后移入玻璃化冷凍液（vitrification solution，VS）液滴中，從VS液滴進(jìn)入液氮的操作過程<1min，操作在室溫下進(jìn)行。復(fù)蘇方法依照玻璃化解凍復(fù)蘇方法進(jìn)行，置入解凍液1號液（warming solution，WS1）中1min，隨后置入2號液中（WS2）3min，再轉(zhuǎn)入3號液中（WS3）5 min，轉(zhuǎn)入4號液中（WS4）5 min后轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)皿中培養(yǎng)待移植。玻璃化冷凍液和解凍液采用日本Kitazato公司加藤系列。

1.2.3臨床妊娠的確認(rèn)胚胎移植后14 d抽血驗(yàn)人絨毛膜促性腺激素，陽性者繼續(xù)黃體支持，14d后B超見孕囊及胎心搏動(dòng)者確定為臨床妊娠，未見者為生化妊娠。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)室結(jié)果

解凍0PN來源囊胚移植的17例，總共獲卵數(shù)212枚，平均（12.47±5.29）枚；成熟卵子數(shù)184枚，卵子成熟率為86.79%，0PN胚胎數(shù)68枚，形成可用囊胚數(shù)39枚，可用囊胚形成率為57.35%。解凍1PN來源囊胚移植的2例，共獲卵數(shù)31枚，平均（15.5± 4.5）枚，成熟卵子數(shù)25枚，卵子成熟率為80.65%，0PN胚胎數(shù)3枚，形成可利用囊胚數(shù)2枚。

2.2臨床隨訪結(jié)果

對0PN來源囊胚解凍移植的17例進(jìn)行隨訪，臨床妊娠6例中有4例足月活產(chǎn)（1例雙胎減1胎刨1女，3例刨1男，活產(chǎn)嬰兒體檢均健康），1例早期流產(chǎn)，1例生化妊娠，其他11例檢查陰性。1PN來源囊胚解凍移植2例，2例隨訪均為陰性。見表1、2。

表1　0PN來源胚胎解凍臨床隨訪結(jié)果

表2　1PN來源胚胎解凍臨床隨訪結(jié)果

3 討論

受精是精子與卵子結(jié)合的一系列復(fù)雜過程，以核膜重新形成，并包繞精源和卵源染色質(zhì)形成精原核和卵原核為結(jié)束標(biāo)志[3]。正常受精卵在授精6～20h后可觀察到2個(gè)清晰的原核，而由于受臨床工作時(shí)間安排限制，本中心一般是授精后16～20 h觀察原核，雌雄原核發(fā)育不同步使單一時(shí)間觀察并不完全準(zhǔn)確[4]，會(huì)有0PN和1PN胚胎發(fā)生。有研究報(bào)道，一些通過光學(xué)顯微鏡觀察認(rèn)為異常的受精卵，經(jīng)細(xì)胞分子生物學(xué)方法證實(shí)是正常的二倍體[5]。馬水英等[6]也報(bào)道，通過延長體外培養(yǎng)的時(shí)間，逐漸篩選掉非二倍體胚胎，可增加正常胚胎的比例。本研究中17例解凍復(fù)蘇移植0PN來源囊胚最后獲得6例臨床妊娠，其中1例停育，1例早期流產(chǎn)，其他已出生的4個(gè)嬰兒均健康，也說明部分0PN來源胚胎是正常2倍體，可獲得一定的妊娠率和出生率。目前，受精的評估主要根據(jù)在適當(dāng)時(shí)間觀察第二極體和原核情況決定。受精是一個(gè)過程，出現(xiàn)第二極體可以作為早期判斷受精的征象，IVF-ET中受精的最終判斷是通過授精后的原核情況判斷。0PN發(fā)生的原因可能是觀察時(shí)間不對，雌雄原核過早融合，導(dǎo)致原核消失或尚未形成，這并不一定提示受精失敗。梁明明等[7]報(bào)道，早期原核消失是預(yù)測胚胎發(fā)育潛能和臨床妊娠結(jié)局的一個(gè)有意義的指標(biāo)。另外有研究指出，胚胎的發(fā)育至融合階段形成囊胚，胚胎基因組激活，并決定胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，能發(fā)育到囊胚階段的胚胎其染色體異常率低[8]。所以在不確定0PN胚胎是否為正常受精胚胎的情況下，醫(yī)師可以通過延長體外培養(yǎng)時(shí)間至發(fā)育到囊胚階段，自然篩選出正?；蛘咦罱咏５呐咛?，可提高胚胎的利用率；在選擇胚胎移植的時(shí)候，充分告知并征得患者同意的情況下，0PN來源囊胚可作為正常胚胎實(shí)施單囊胚移植，以便于患者接受產(chǎn)前檢查。

體外受精過程中，1PN的發(fā)生率為3%～6%。其產(chǎn)生機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)：①孤雌或孤雄原核的發(fā)生；②卵母細(xì)胞的孤雌激活；③雌雄原核融合；④雌雄原核不同步發(fā)育導(dǎo)致單一時(shí)間內(nèi)僅觀察到1個(gè)原核。而由于光學(xué)顯微鏡不能判斷1PN胚胎是來源于雌雄原核發(fā)育不同步或是異常受精，且多數(shù)1PN胚胎存在染色體異常，易發(fā)育停滯導(dǎo)致囊胚形成率低，故而認(rèn)為其不具有移植價(jià)值。一些學(xué)者對IVF來源和ICSI來源的1PN胚胎進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)研究對比，發(fā)現(xiàn)IVF來源的1PN胚胎的正常二倍體率顯著高于ICSI來源[9]。本研究選取的胚胎均為IVF來源。有報(bào)道通過移植1PN胚胎獲得健康出生嬰兒，認(rèn)為可以通過囊胚培養(yǎng)的方法對其進(jìn)行發(fā)育潛能的篩選，增加臨床移植應(yīng)用的機(jī)會(huì)[10]。目前對于1PN胚胎的研究尚缺乏大樣本量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，本研究僅有2例1PN來源囊胚應(yīng)用解凍移植，且未獲得臨床妊娠結(jié)果，關(guān)于1PN來源囊胚是否可用于移植還存在爭議，有待進(jìn)一步探索研究。

[1]梁鑫,單旭東,漆著,等.囊胚培養(yǎng)及廢棄胚胎臨床研究[J].中國婦幼保健,2015,30(34):6103-6106.

[2]GARDNER D K,LANE M,STEVENS J,et al.Blastocyst score affects implantation and prednancy out come:towards a single blasto-cyst transfer[J].Fertil Steril,2000,73(6):1155-1158.

[3]黃國寧.輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2014: 39-45.

[4]鄒林兵,戴志俊,張芳芳,等.來源未見原核（0PN）卵裂期胚胎移植的臨床分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2015,6:104-105.

[5]張亞楠,殷寶莉,張翠蓮,等.IVF-ET周期中1原核（PN）及0PN（2Pb）胚胎的染色體組成分析[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2016,25(1):32-38.

[6]馬水英,李梅,李城,等.體外受精周期中不同原核數(shù)發(fā)育囊胚使用價(jià)值的探討[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2014,6:452-454.

[7]梁明明,唐永梅,韋繼紅,等.早期卵裂胚胎的發(fā)育和妊娠結(jié)局[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2015,5:112-114.

[8]HUANG F J,HUANG H W,LAN K C,et al.The maturity of cumulus-free oocytes is positively related to blastocyst de-velopement and viability[J].J Assist Reprod Genet,2002,19(12):555-559.

[9]袁萍,王文軍,李瑞岐,等.IVF-ET周期中單原核胚胎的形態(tài)學(xué)及體外發(fā)育潛能[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2014,6:823-829.

[10]GRAS L,TROUNSON A O.Pregency and birth resulting from transfer of a blastocyst observed to have one pronucleus at the time of examination for fertilization[J].Hum Reprod,1999,14(7): 1869-1871.

（童穎丹編輯）

R 714.8

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.028

1005-8982（2016）19-0132-03

2016-03-01

廣西壯族自治區(qū)人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目（No：桂人口計(jì)生研1102、桂人口計(jì)生研1109、桂人口計(jì)生研1305）

牛向麗，E-mail：59075287@qq.com