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        5′-羥基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚與人血清白蛋白結(jié)合特征研究

        2016-11-08 11:12:55楊露露伍智蔚易忠勝
        分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2016年9期
        關(guān)鍵詞:二苯醚能量轉(zhuǎn)移作用力

        楊 霧,楊露露,伍智蔚,易忠勝

        (廣西高校食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心,桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西 桂林 541004)

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        5′-羥基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚與人血清白蛋白結(jié)合特征研究

        楊霧,楊露露,伍智蔚,易忠勝*

        (廣西高校食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心,桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西桂林541004)

        在模擬生理環(huán)境下,通過穩(wěn)態(tài)熒光光譜、時(shí)間分辨熒光光譜、傅立葉變換紅外光譜和三維熒光光譜等方法研究了5′-羥基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚(5′-OH-BDE-99)與人血清白蛋白的結(jié)合特征,并結(jié)合分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了分析。熒光光譜實(shí)驗(yàn)、非輻射能量轉(zhuǎn)移理論及動(dòng)力學(xué)模擬研究表明,5′-OH-BDE-99能使HSA 發(fā)生猝滅作用,且猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。傅立葉變換紅外光譜、三維熒光光譜及動(dòng)力學(xué)模擬研究表明,5′-OH-BDE-99可誘導(dǎo)HSA 構(gòu)象和周圍環(huán)境發(fā)生變化。此外,分子對(duì)接和熱力學(xué)方法研究表明,二者間的主要作用力為疏水作用力。

        多溴二苯醚;人血清白蛋白;熒光光譜;分子對(duì)接;動(dòng)力學(xué)模擬

        多溴二苯醚(Polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一種重要的溴代阻燃劑,廣泛應(yīng)用于電子產(chǎn)品、紡織品和建筑材料等領(lǐng)域[1]。由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且難以降解,因而在環(huán)境中造成了一定的污染,近年來受到越來越多的關(guān)注。多溴二苯醚的衍生物羥基化多溴二苯醚(Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers,OH-PBDEs)作為一種新型的環(huán)境污染物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)與PBDEs 相似,但生物毒性更大。OH-PBDEs 結(jié)構(gòu)與甲狀腺素和三碘甲狀腺原氨酸的結(jié)構(gòu)相似,因而表現(xiàn)出相似的特征進(jìn)而干擾人體的內(nèi)分泌平衡[2]。

        人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是人體內(nèi)血液中含量最為豐富的載體蛋白質(zhì),其含量約為40 mg/L,約占血漿總蛋白含量的60%[3],具有運(yùn)輸和維持正常血液滲透壓的功能。它對(duì)大量的外源性和內(nèi)源性物質(zhì)如代謝產(chǎn)物、脂肪酸、氨基酸、膽紅素及藥物的運(yùn)輸和分配有重要作用。研究新型環(huán)境污染物與HSA 的結(jié)合特征,可以進(jìn)一步分析HSA 的生理活性及其作用機(jī)制。一方面,OH-PBDEs 能夠經(jīng)食物鏈在人體內(nèi)長(zhǎng)期積累并表現(xiàn)出各種潛在毒性,另一方面,它可隨血液運(yùn)輸、傳遞,進(jìn)而與HSA 結(jié)合形成復(fù)合物體系。本文模擬人體微環(huán)境[4-6],在pH 7.4,T=310 K 的條件下對(duì)5′-羥基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚(5′-OH-BDE-99) 與HSA 的結(jié)合進(jìn)行光譜研究,并結(jié)合計(jì)算模擬的方法進(jìn)一步分析了其結(jié)合特征,從而揭示5′-羥基-2,2′,4,4′,5-五溴二苯醚對(duì)人體的影響。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1儀器與試劑

        RF-5301PC 熒光分光光度計(jì)(日本島津公司);F-4600 熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司);FL3-P-TCSPC 時(shí)間分辨熒光儀(法國(guó)Horiba Jobin Yvon公司);TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司);EL204 電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);pHS-3C 型精密pH 計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

        人血清白蛋白(HSA,美國(guó)Sigma 公司);5′-OH-BDE-99(美國(guó)AccuStandard 公司);pH 7.4 Tris-HCl 緩沖液(實(shí)驗(yàn)室配制);其他試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次水。

        1.2實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1光譜法穩(wěn)態(tài)熒光:準(zhǔn)確移取1 mL 1.0×10-5mol/L HSA 溶液于10 mL 比色管中,分別加入不同濃度的5′-OH-BDE-99 溶液,并用Tris-HCl 緩沖溶液定容。分別在290,298,310 K溫度下恒溫5 min,設(shè)定參數(shù)并測(cè)定其熒光光譜。

        時(shí)間分辨熒光光譜:采用TCSPC 方法測(cè)定,設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)334 nm,預(yù)設(shè)置計(jì)數(shù)峰值counts 為5000,獲得熒光衰減時(shí)間。

        三維熒光光譜:激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)范圍均為200~500 nm,分別測(cè)定HSA 游離體系和5′-OH-BDE-99 -HSA 復(fù)合物體系的三維熒光光譜。

        紫外光譜:以Tris-HCl 緩沖液作為參比液,測(cè)定紫外光譜。

        紅外光譜:用KBr 壓片,測(cè)定HSA 游離體系和5′-OH-BDE-99-HSA 復(fù)合物體系的紅外光譜。

        1.2.2動(dòng)力學(xué)模擬法在DELL 服務(wù)器、RedHat Linux 系統(tǒng)中進(jìn)行模擬運(yùn)算。HSA 晶體結(jié)構(gòu)的代碼為1AO6(從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.rcsb.org/pdb中獲得)。

        利用Autodock 4.2 進(jìn)行對(duì)接,對(duì)接過程中先對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行前處理(去水,加氫,加電荷等),GridBox 為70 ?×70 ?×70 ?,間距0.375 ?。用Lamarckian GA算法運(yùn)算,將配體小分子5′-OH-BDE-99 與HSA 進(jìn)行對(duì)接。

        動(dòng)力學(xué)模擬采用GROMACS 4.6.5程序進(jìn)行10 ns的運(yùn)算。模擬力場(chǎng)設(shè)定為GROMOS96 43A1,并使用單一點(diǎn)電荷SPC 水模型對(duì)HSA 游離體系和HSA-5′-OH-BDE-99 復(fù)合物體系分別添加溶劑、建立水盒子、添加抗衡離子、能量最小化,建立平衡系統(tǒng),計(jì)算并進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。

        2 結(jié)果與討論

        2.1計(jì)算模擬研究

        2.1.1結(jié)合作用分析分子對(duì)接可用于分析5′-OH-BDE-99 與HSA 的結(jié)合作用情況,并確定其結(jié)合位點(diǎn)的相關(guān)信息。利用Autodock 軟件對(duì)5′-OH-BDE-99 與HSA 進(jìn)行對(duì)接,結(jié)果表明,5′-OH-BDE-99 與HSA 結(jié)合在位點(diǎn)Ⅰ(圖1A),其VDW 1.0范圍內(nèi)氨基酸殘基以π-cation 作用和疏水作用力的形式鍵合(圖1B)。其中,氨基酸殘基Tyr150,Lys195,Arg218,Leu219,Arg222,Leu238,Arg257,Leu260,Ala291 與5′-OH-BDE-99 以疏水作用力結(jié)合而形成疏水空腔,說明5′-OH-BDE-99 與HSA 間的結(jié)合受到較強(qiáng)疏水作用力影響(圖1C)。此外,5′-OH-BDE-99 與氨基酸殘基Lys195 和Arg222 間還存在π-cation 作用(圖1D),使二者結(jié)合更加穩(wěn)定,因此引起HSA 的微環(huán)境改變。分析配體小分子與HSA 的結(jié)合作用,這對(duì)維持蛋白大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu),如α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等起到重要作用,即能穩(wěn)定二者結(jié)合所形成的配合物。

        圖1 5′-OH-BDE-99 在HSA位點(diǎn)Ⅰ的相互作用圖Fig.1 The interaction between 5′-OH-BDE-99 and HSA at site ⅠA:binding site(結(jié)合位點(diǎn));B:VDW 1.0 range of amino acid residues(VDW 1.0范圍氨基酸) ;C:hydrophobic force(疏水作用力);D:π-cation interaction( π-cation 作用)

        利用GROMACS 4.6.5 程序并采用MM-PBSA 方法[7]模擬計(jì)算結(jié)合自由能。在與5′-OH-BDE-99 形成復(fù)合物的過程中,HSA每個(gè)氨基酸殘基對(duì)能量均有一定的貢獻(xiàn),其中疏水性氨基酸Ala291,Leu238,Ile290 對(duì)自由能貢獻(xiàn)較大(圖2),與配體小分子5′-OH-BDE-99 形成穩(wěn)定的相互作用,說明疏水作用力是促使HSA 與5′-OH-BDE-99 結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力。

        圖2 不同氨基酸殘基對(duì)自由能的貢獻(xiàn)Fig.2 Different residues contribution of free energy

        2.1.2結(jié)構(gòu)分析通過分子動(dòng)力學(xué)模擬可以研究5′-OH-BDE-99 與HSA 結(jié)合在位點(diǎn)Ⅰ的水溶液中的動(dòng)力學(xué)情況。根據(jù)均方根偏差RMSD、均方根波動(dòng)RMSF 及蛋白質(zhì)回旋半徑Rg 等可以判斷二者相互作用后結(jié)構(gòu)的變化。

        HSA 以及其復(fù)合物體系的蛋白質(zhì)相對(duì)初始結(jié)構(gòu)偏差(RMSD)見圖3A。從整體觀察,5′-OH-BDE-99 在整個(gè)模擬過程中RMSD 值的變化幅度不大,表明5′-OH-BDE-99 能夠與HSA 形成穩(wěn)定復(fù)合物,且使復(fù)合物體系趨于穩(wěn)定?;跉埢治龅木礁▌?dòng)RMSF 可查看局部蛋白質(zhì)殘基柔性的變化(圖3B),HSA 與5′-OH-BDE-99 結(jié)合使蛋白氨基酸柔性發(fā)生變化,進(jìn)而使HSA 內(nèi)部微環(huán)境和構(gòu)象發(fā)生改變。蛋白質(zhì)的回旋半徑Rg值用于度量結(jié)構(gòu)的緊密度(圖3C),HSA-5′-OH-BDE-99 體系的回轉(zhuǎn)半徑最終穩(wěn)定在2.6 ?左右,而HSA 游離體系則最終穩(wěn)定在2.55 ?左右,表明HSA 中加入5′-OH-BDE-99 使HSA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。HSA 因其結(jié)構(gòu)部分狀態(tài)改變而變得更膨松,從而說明5′-OH-BDE-99 與HSA 結(jié)合時(shí)發(fā)生了一定的構(gòu)象改變。

        圖3 10 ns MD模擬的HSA 體系和HSA-5′-OH-BDE-99體系的 RMSD(A)、RMSF(B)與Rg(C)Fig.3 Root mean square deviation (RMSD,A),root mean square fluctuation(RMSF,B) and radius of gyration(Rg,C) of free HSA and HSA-5′-OH-BDE-99 complexes from 10 ns of MD simulations

        圖4 10 ns MD模擬的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Changes of secondary structure over 10 ns of MD simulation

        從疏水性殘基可及表面積SASA 與蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化可以作進(jìn)一步分析。游離的HSA 與復(fù)合體系HSA 比較,疏水性及表面積由144.56 nm2增至166.37 nm2,而親水性及表面積則從135.97 nm2降至129.98 nm2。加入5′-OH-BDE-99 后,氨基酸間殘基的排斥作用增強(qiáng),導(dǎo)致HSA 的結(jié)構(gòu)變得疏松,HSA 微環(huán)境的疏水性增強(qiáng),二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。同時(shí),從10 ns 模擬后的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化(圖4)可觀察到,加入5′-OH-BDE-99 后,α-螺旋與β-橋含量增加,β-轉(zhuǎn)角、彎曲、無規(guī)則卷曲、5-螺旋與3-螺旋含量均有所降低。從前后變化可知,加入5′-OH-BDE-99 改變了HSA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

        圖5 5′-OH-BDE-99 對(duì)HSA 的熒光猝滅光譜和Stern-Volmer 曲線Fig.5 Fluorescence spectra of HSA in the presence of 5′-OH-BDE-99 and Stern-Volmer curve [HSA]=1.0×10-6 mol/L;[5′-OH-BDE-99]=0,1,2,3,4,5,6,7,8,9(×10-8 mol/L);298K

        2.2實(shí)驗(yàn)研究分析

        2.2.1穩(wěn)態(tài)熒光熒光猝滅主要分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移[8]。在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm下,HSA 內(nèi)源性熒光主要由色氨酸、酪氨酸與苯丙氨酸的氨基酸殘基產(chǎn)生,由于苯丙氨酸殘基的熒光量子產(chǎn)率很低,可忽略不計(jì)。一定溫度條件下,隨著5′-OH-BDE-99 濃度逐漸增加,HSA 內(nèi)源性熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)有規(guī)律的降低(圖5)。表明5′-OH-BDE-99 能夠與HSA 結(jié)合作用,導(dǎo)致HSA 熒光猝滅。采用Stern-Volmer 方程[9]計(jì)算猝滅速率常數(shù):F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q],式中,F(xiàn)0和F分別為游離態(tài)HSA 與加入5′-OH-BDE-99復(fù)合體系的熒光強(qiáng)度,Ksv為猝滅速率常數(shù),[Q]為5′-OH-BDE-99的平衡濃度,Kq為雙分子猝滅速率常數(shù),τ0為無猝滅劑時(shí)生物大分子內(nèi)源性熒光的平均壽命(其值約為10-8s)。

        根據(jù)Stern-Volmer 方程進(jìn)行線性擬合,并計(jì)算出不同溫度下的Ksv和Kq。由圖5及表1可知,Kq隨溫度升高而逐漸降低,且Kq值遠(yuǎn)大于猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1[10],因此可判斷其猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。同時(shí),也說明5′-OH-BDE-99 與HSA 發(fā)生相互作用形成了復(fù)合物,使HSA 內(nèi)部的疏水作用力增強(qiáng),導(dǎo)致HSA 構(gòu)象變化,使HSA 熒光發(fā)生猝滅。

        表1 HSA-5′-OH-BDE-99 的熒光猝滅常數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及相關(guān)熱力學(xué)常數(shù)*Table 1 Fluorescence quenching constants,apparent binding constants,binding sites and relative thermodynamic parameters of HSA-5′-OH-BDE-99 system*

        *R1is the correlation ofKsv,R2is the correlation ofKa(R1為Ksv的相關(guān)系數(shù),R2為Ka的相關(guān)系數(shù))

        圖6 HSA 在5′-OH-BDE-99 存在下的時(shí)間分辨熒光衰減曲線Fig.6 Time-resolved fluorescence decays curve of HSA in the presence of 5′-OH-BDE-99[HSA]=1×10-6 mol/L

        2.2.2時(shí)間分辨熒光光譜時(shí)間分辨熒光光譜是用于研究蛋白與小分子相互作用的重要工具。根據(jù)Lakowicz 理論[11],利用時(shí)間分辨熒光可以區(qū)分靜態(tài)和動(dòng)態(tài)猝滅。圖6為HSA 在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)334 nm下的時(shí)間分辨熒光衰減曲線,加入5′-OH-BDE-99 與HSA 結(jié)合后,時(shí)間壽命衰減,熒光發(fā)生猝滅。另一方面,加入不同濃度5′-OH-BDE-99 后的時(shí)間壽命衰減時(shí)間在4.20 ns左右(見表2),變化不大,說明其所處的微環(huán)境未發(fā)生太大的變化,可知此為靜態(tài)猝滅。這與穩(wěn)態(tài)熒光得到的結(jié)論相吻合,證明了HSA 與5′-OH-BDE-99 發(fā)生相互作用后,使蛋白微環(huán)境發(fā)生改變,進(jìn)而產(chǎn)生熒光猝滅。

        表2 HSA 與HSA-5′-OH-BDE-99 體系的熒光壽命Table 2 Fluorescence lifetime of HSA and HSA-5′-OH-BDE-99 system

        2.2.3能量轉(zhuǎn)移為進(jìn)一步驗(yàn)證其猝滅機(jī)理,根據(jù)紫外光譜和F?rster 偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[12-13]判斷其猝滅機(jī)制。圖7為5′-OH-BDE-99 的紫外吸收光譜圖與HSA 的熒光光譜圖的重疊圖譜,利用矩形分割法將光譜重疊部分分割成極小的矩形面積求和,并依據(jù)公式(1~3)[14]進(jìn)行計(jì)算:

        J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ

        (1)

        R0=8.8×10-25K2N-4φJ(rèn)

        (2)

        (3)

        式中,J為熒光發(fā)射光譜與吸收光譜的重疊積分,R0為E=50%的臨界距離,K2=2/3,N為介質(zhì)折射常數(shù)(實(shí)驗(yàn)中取水和有機(jī)物折射指數(shù)的平均值,即1.34),φ為人血清白蛋白的熒光量子產(chǎn)率。經(jīng)計(jì)算得兩光譜重疊區(qū)積分為J=3.427×10-14cm3·L·mol-1,臨界距離R0=3.13 nm,能量轉(zhuǎn)移效率E=0.304。結(jié)合位置與色氨酸殘基的距離r=3.60 nm<7 nm,滿足0.5R

        圖7 HSA 熒光光譜(a)與5′-OH-BDE-99吸收光譜(b)的重疊圖Fig.7 The overlap of fluorescence spectrum of HSA(a) and absorption spectrum of 5′-OH-BDE-99(b) [HSA]=[5′-OH-BDE-99]=1.0×10-6 mol/L

        2.2.45′-OH-BDE-99 與HSA 作用類型的確定 配體小分子與蛋白質(zhì)大分子的相互作用力主要有4種,分別為疏水作用力、靜電引力、范德華力和氫鍵作用力[16]。利用反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù),可判斷兩者相互作用類型。Ross 等研究表明[17],ΔH>0,ΔS>0為疏水作用力;ΔH<0,ΔS<0為氫鍵和范德華力;ΔH<0,ΔS>0為靜電作用力;ΔG<0表明為自發(fā)反應(yīng)。根據(jù)熱力學(xué)公式[18]及不同溫度下復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)Ka,可求出5′-OH-BDE-99 與HSA 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)(見表1),實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到:ΔG<0,ΔH>0,ΔS>0。由此推斷5′-OH-BDE-99 與HSA 相互作用為自發(fā)的吸熱過程,且主要驅(qū)動(dòng)力為疏水作用力。

        2.2.5結(jié)合位點(diǎn)與表觀結(jié)合常數(shù)的確定配體小分子與蛋白大分子相互作用的結(jié)合位點(diǎn)n與表觀結(jié)合常數(shù)Ka可由公式[19]確定:log[(F0-F)/F]=logKa+nlog[Q]。式中F0和F分別為游離態(tài)HSA 與加入5′-OH-BDE-99 復(fù)合體系的熒光強(qiáng)度,Ka為表觀結(jié)合常數(shù),n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù),[Q]為5′-OH-BDE-99 的濃度。根據(jù)公式作圖可得到不同濃度的5′-OH-BDE-99 對(duì)HSA 熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線,由雙對(duì)數(shù)曲線的截距與斜率可得5′-OH-BDE-99 與HSA 的表觀結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n(見表1)。

        由表1 可得,實(shí)驗(yàn)具有良好的相關(guān)系數(shù),結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n約為1,表明在5′-OH-BDE-99 與HSA 作用時(shí)可能只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。5′-OH-BDE-99 與HSA 的結(jié)合常數(shù)在106數(shù)量級(jí)以上,其結(jié)合常數(shù)較大且溫度對(duì)結(jié)合常數(shù)的影響不大,說明5′-OH-BDE-99 與HSA 的結(jié)合能力較強(qiáng),5′-OH-BDE-99 與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用結(jié)合后,可被蛋白質(zhì)儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)。

        2.2.6競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)通常用于確定小分子與蛋白大分子作用的結(jié)合位點(diǎn)。由于華法林和布洛芬與蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的結(jié)合作用,且其結(jié)合位點(diǎn)分別在蛋白的位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ,故競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中常用華法林和布洛芬作為熒光探針。華法林和布洛芬作為熒光探針能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)的不同區(qū)域進(jìn)行特異性結(jié)合,從而確定小分子與蛋白大分子相互作用的結(jié)合區(qū)域及結(jié)合位點(diǎn)。由Stern-Volmer 的修正方程[20]可得到競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)合常數(shù):F0/(F0-F)=1/f+1/(f·Ka·[Q]),式中F0為游離態(tài)HSA 體系的熒光發(fā)射強(qiáng)度,F(xiàn)為加入5′-OH-BDE-99 后HSA 體系的熒光發(fā)射強(qiáng)度,f為修正因子,Ka為結(jié)合常數(shù),[Q] 為5′-OH-BDE-99 的濃度。

        根據(jù)Stern-Volmer 的修正方程可求出加入探針前后的結(jié)合常數(shù)K。未加探針之前的5′-OH-BDE-99 與HSA 結(jié)合常數(shù)(2.36×107L/mol)和加入Ibuprofen 后的結(jié)合常數(shù)(2.24×107L/mol)很接近,而加入Warfarin 后5′-OH-BDE-99 與HSA 的結(jié)合常數(shù)(0.23×107L/mol)明顯小于未加探針之前,說明5′-OH-BDE-99 與HSA 的結(jié)合位置在位點(diǎn)Ⅰ結(jié)合空腔,此結(jié)果與前述分子對(duì)接結(jié)果相吻合。

        2.2.8三維熒光光譜三維熒光光譜提供了蛋白質(zhì)更多更為詳細(xì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息[22],通過比較加入小分子后HSA 的三維熒光光譜圖變化,可以獲得HSA 的構(gòu)象和微環(huán)境信息,從而判斷其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(圖8)。圖8中峰a 是瑞利散射峰(λex=λem),峰b 為二階散射峰(2λex=λem)。加入5′-OH-BDE-99 后,由于形成HSA-5′-OH-BDE-99 復(fù)合體系而導(dǎo)致HSA 直徑增大,瑞利散射增強(qiáng),熒光強(qiáng)度增加。峰1 是色氨酸和酪氨酸的熒光特征峰,對(duì)比圖8A和B可知,峰1 熒光強(qiáng)度顯著降低且最大發(fā)射波長(zhǎng)處發(fā)生了微弱的藍(lán)移,表明色氨酸極性微環(huán)境改變,內(nèi)部疏水性增強(qiáng),即HSA 結(jié)構(gòu)變化。峰 2 是HSA 中與螺旋、卷曲等肽骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)的信息峰,主要由π→π*遷移引起[23],此峰熒光強(qiáng)度降低且發(fā)生微弱的紅移,說明加入5′-OH-BDE-99 影響了HSA的 二級(jí)結(jié)構(gòu)。

        圖8 HSA(A)與 HSA-5′-OH-BDE-99 (B)的三維熒光光譜Fig.8 Three-dimensional fluorescence spectra of HSA(A) and HSA-5′-OH-BDE-99 (B) [HSA]=4.0×10-6 mol/L;[5′-OH-BDE-99 ]=2.0×10-7 mol/L

        3 結(jié) 論

        本文采用穩(wěn)態(tài)熒光、時(shí)間分辨熒光、傅立葉變換紅外光譜、三維熒光光譜及分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬等方法,分析了5′-OH-BDE-99 與HSA 間的結(jié)合作用情況,結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)研究與計(jì)算模擬相一致。5′-OH-BDE-99 對(duì)HSA 具有熒光猝滅作用,猝滅機(jī)制主要為靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移,結(jié)合作用主要驅(qū)動(dòng)力為疏水作用力。通過熒光探針研究以及計(jì)算模擬確定5′-OH-BDE-99 特異性結(jié)合HSA 在華法林結(jié)合位點(diǎn)(位點(diǎn)Ⅰ)。利用傅立葉變換紅外光譜、三維熒光光譜及動(dòng)力學(xué)模擬研究了5′-OH-BDE-99 對(duì)HSA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,表明HSA 游離體系和HSA-5′-OH-BDE-99 復(fù)合物體系在動(dòng)力學(xué)模擬中能夠達(dá)到穩(wěn)定,并發(fā)生一定的構(gòu)象變化。對(duì)5′-OH-BDE-99 與HSA 結(jié)合作用及其特征的研究,有助于理解羥基化多溴二苯醚類環(huán)境干擾物在生物過程中的毒性,還可為其毒理研究提供一定的數(shù)據(jù)信息。

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        Study on the Binding Characteristics of 5′-Hydroxy-2,2′,4,4′,5-pentabromo Diphenyl Ether and Human Serum Albumin

        YANG Wu,YANG Lu-lu,WU Zhi-wei,YI Zhong-sheng*

        (Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection,Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area,College of Chemistry and Bioengineering,Guilin University of Technology,Guilin541004,China)

        The primary objective of this study is to evaluate the binding characteristics of human serum albumin(HSA) and 5′-hydroxy-2,2′,4,4′,5-pentabromo diphenyl ether(5′-OH-BDE-99) in physiological conditions.Several spectroscopy techniques such as steady-state fluorescence spectroscopy,time-resolved fluorescence,FTIR and three-dimensional fluorescence spectrometry,combined with molecular docking and molecular dynamics simulation were employed to comprehensively analyze the mechanism of interaction between 5′-OH-BDE-99 and HSA.The results of fluorescence spectroscopy experiments,non-radiation energy transfer theory and dynamic simulation showed that 5′-OH-BDE-99 could quench the intrinsic fluorescence of HSA through static quenching mechanism.The experiments of FTIR,three-dimensional fluorescence spectra and dynamic simulation revealed that the binding of 5′-OH-BDE-99 to HSA could induce conformational and microenvironmental changes.Moreover,according to molecular docking and thermodynamic method,hydrophobic force is the main acting force.

        polybrominated diphenyl ethers;human serum albumin(HSA);fluorescence spectroscopy;molecular docking;dynamic simulation

        2016-03-15;

        2016-04-21

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21267008);廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013GXNSFAA019034);廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及卓越學(xué)者計(jì)劃項(xiàng)目(桂教人〔2014〕49號(hào))

        易忠勝,博士,教授,研究方向:化學(xué)計(jì)量學(xué)與環(huán)境毒理學(xué),Tel:0773-5898551,E-mail:yzs@glut.edu.cn

        研究報(bào)告

        10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.001

        O657.3;TQ314.248

        A

        1004-4957(2016)09-1079-08

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