張紅蕾，徐志棟，李　瑋,2*，楊瑜濤，杜　潔，韓孟楠，王爍康

(1.河北大學(xué)　化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北　保定　071002；2.河北博倫特藥業(yè)有限公司，河北　石家莊　052263)

?

生物轉(zhuǎn)化L-脯氨酸生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的定量分析方法

張紅蕾1，徐志棟1，李瑋1,2*，楊瑜濤1，杜潔1，韓孟楠1，王爍康1

(1.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定071002；2.河北博倫特藥業(yè)有限公司，河北石家莊052263)

以芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)為柱前衍生劑，四硼酸鈉為緩沖溶液，建立了一種柱前衍生反相高效液相色譜(RP-HPLC)測(cè)定微生物轉(zhuǎn)化L-脯氨酸生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的定量分析方法。優(yōu)化了衍生反應(yīng)條件，當(dāng)衍生反應(yīng)體系中水和乙腈的比例為66∶34，pH值為9.9時(shí)衍生效果最佳。采用Agilent Extend C-18柱進(jìn)行分離，以0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長263 nm。L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸均在0.01～5.00 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為5.00～7.00 ng/L，不同濃度下的平均回收率分別為98.9%～102%和97.9%～100%。該方法重現(xiàn)性好，精密度高，為定量分析微生物發(fā)酵液中的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸提供了有效方法。

柱前衍生；反相高效液相色譜；反式-4-羥基-L-脯氨酸；L-脯氨酸；微生物轉(zhuǎn)化

反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，trans-Hyp)為亞氨基酸，是L-脯氨酸 (L-Pro) 羥基化后的產(chǎn)物，易于衍生，藥理活性多樣[1-2]，可用于新一代培南類抗生素[3]、抗腫瘤藥[4]、抗高血壓藥[5]及新型胃藥[6]等多種新創(chuàng)制藥物的合成。由于具有抗氧化、抗輻射的作用，該物質(zhì)在化妝品領(lǐng)域也有重要應(yīng)用[7]。

目前，反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)方法主要有生物提取法和生物酶催化轉(zhuǎn)化法[8-11]。生物提取法主要以動(dòng)物膠原蛋白為原料，通過強(qiáng)酸水解、亞硝酸氧化和離子交換樹脂純化等過程制備，此方法雖然技術(shù)成熟，但原料成本高，提取率低，“三廢”排放量大、污染嚴(yán)重。生物酶催化法利用脯氨酸羥化酶的催化特性，以L-脯氨酸為原料通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化得到反式-4-羥基-L-脯氨酸。生物轉(zhuǎn)化法與生物提取法相比反應(yīng)條件溫和，能耗低，污染小。本實(shí)驗(yàn)室曾篩選到一株可以生物轉(zhuǎn)化L-脯氨酸產(chǎn)生反式-4-羥基-L-脯氨酸的重組大腸桿菌工程菌[12]。

在反式-4-羥基-L-脯氨酸的微生物轉(zhuǎn)化及生產(chǎn)中，對(duì)其含量進(jìn)行分析十分重要。目前，文獻(xiàn)已報(bào)道的反式-4-羥基-L-脯氨酸的定量分析方法大部分采用氯胺T法[13]，該方法簡(jiǎn)便易操作，但檢測(cè)濃度范圍較窄，且只能對(duì)羥脯氨酸定量，無法反映脯氨酸的變化情況。高效液相色譜可解決這一問題，本文借鑒衍生試劑柱前衍生氨基酸的高效液相色譜分析方法[14-16]，利用芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)與樣品進(jìn)行衍生反應(yīng)，對(duì)衍生體系中水和乙腈的比例進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)衍生化樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，該方法前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍寬、重復(fù)性好、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，為應(yīng)用高效液相色譜分離及定量分析微生物轉(zhuǎn)化體系中L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸提供了有效方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與材料

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Centrifuge 5424R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；ZWYR-200D振蕩培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；Vortex-5旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；BT125D天平(德國Sartorius公司)。

L-脯氨酸、反式-4-羥基-L-脯氨酸、FMOC-Cl、十水合四硼酸鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；三氟乙酸(上海麥恪林生化科技有限公司)；乙腈、甲醇(安徽時(shí)聯(lián)特種試劑有限公司)；LB培養(yǎng)基(生工生物工程股份有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸適量，用水配制成濃度為50.00 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別將上述兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液用水梯度稀釋至0.01,0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mg/mL。于4 ℃保存，備用。

1.3衍生化方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)品衍生化 分別吸取“1.2”中不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL于1.5 mL EP管中,向每支EP管內(nèi)分別加入200 μL 0.125 mol/L四硼酸鈉水溶液、410 μL水、320 μL乙腈、20 μL FMOC-Cl的乙腈溶液(0.38 mol/L)，置于渦旋混勻器振蕩5 s后靜置10 min，過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)行RP-HPLC檢測(cè)。

1.3.2待測(cè)樣品衍生化 重組大腸桿菌接種于含3.00 g/LL-脯氨酸的LB培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，將大腸桿菌發(fā)酵液以9 000 r/min離心2 min,取50 μL上清液加入1.5 mL離心管內(nèi)，并加入0.125 mol/L四硼酸鈉水溶液200 μL、水410 μL、乙腈320 μL、0.38 mol/L FMOC-Cl的乙腈溶液20 μL，置于渦旋混勻器振蕩5 s后靜置10 min，過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)行RP-HPLC分析。

1.4RP-HPLC分析條件

色譜柱為Agilent Extend C-18(4.6 mm ×250 mm，5 μm，Agilent公司)，流動(dòng)相A為0.1% 三氟乙酸水溶液,B為0.1% 三氟乙酸乙腈溶液，檢測(cè)波長263 nm，進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫條件∶0～5 min，30% B；5～8 min，30%～40% B；8～15 min，40% B；15～20 min，40%～50% B；20～25 min，50% B；25～30 min，50%～90% B；30～38 min，90% B；38～41 min，90%～30% B；41～45 min，30% B。

1.5衍生化樣品的穩(wěn)定性測(cè)定

分別配制濃度為0.20，1.00，5.00 mg/mL 的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行衍生化處理后,再分別于4 ℃、室溫(RT)和37 ℃放置20 h后取出進(jìn)行液相色譜分析，以室溫放置0 h的衍生化樣品為對(duì)照。并采用RP-HPLC對(duì)4 ℃保存0，12，24，48，72 h的不同濃度衍生化樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與討論

2.1衍生條件優(yōu)化

2.1.1衍生體系緩沖鹽的選擇 對(duì)衍生體系3種不同緩沖鹽溶液進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，以N-甲基嗎啉鹽酸鹽(0.125 mol/L)作為緩沖鹽時(shí)，L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的衍生產(chǎn)物不出峰；以三乙胺(0.125 mol/L)作為緩沖鹽時(shí)有目標(biāo)峰，但相鄰有雜峰干擾；以四硼酸鈉(0.125 mol/L)作為緩沖鹽時(shí)，不僅有呈高斯對(duì)稱的目標(biāo)峰，無雜峰干擾，且峰面積最大。綜上所述，選擇最佳緩沖鹽為四硼酸鈉。

2.1.2衍生體系水與乙腈比例的選擇 對(duì)衍生體系中水與乙腈的不同比例進(jìn)行了研究。在不同水和乙腈比例條件下，5.00 mg/mLL-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生結(jié)果如表1所示，當(dāng)水和乙腈的比例為98∶2和82∶18時(shí)有FMOC-Cl結(jié)晶析出，衍生產(chǎn)物的峰高較低；當(dāng)水和乙腈的比例為50∶50和34∶66時(shí)有四硼酸鈉結(jié)晶析出，且衍生產(chǎn)物的峰嚴(yán)重拖尾；當(dāng)水和乙腈的比例為66∶34時(shí)，衍生產(chǎn)物無色透明，峰形呈高斯對(duì)稱，且半峰寬較窄，無明顯拖尾，故選擇該比例下0.38 mol/L衍生劑用量20 μL。在該比例下緩沖體系的pH值為9.9，滿足上述兩種氨基酸易于在堿性環(huán)境中衍生的條件。

表1　不同比例的水和乙腈對(duì)衍生效果的影響Table 1　Effect of different proportions for water and acetonitrile on derivatization

2.1.3衍生反應(yīng)時(shí)間的選擇將5.00 mg/mLL-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的衍生反應(yīng)體系分別靜置0，1，5，10，15，20 min后，采用RP-HPLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨反應(yīng)時(shí)間的延長，兩種氨基酸的峰面積相應(yīng)增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，峰面積達(dá)到最大，反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長，峰面積反而下降。故選擇最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間為10 min。

2.2線性范圍、檢出限與回收率

在“2.1”優(yōu)化條件下，對(duì)不同濃度(0.01,0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mg/mL)的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后，采用高效液相色譜進(jìn)行分析，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣5次，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x,mg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的線性方程分別為y=33.79x+0.983 0和y=38.86x+0.939 7，相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.999 9和0.999 8，線性范圍均為0.01～5.00 mg/mL。當(dāng)信噪比為4時(shí)，L-脯氨酸和L-羥脯氨酸的檢出限分別為7.00 ng/L 和5.00 ng/L。重復(fù)測(cè)定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液5次，L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的平均回收率分別為98.9%～102%和97.9%～100%。

2.3精密度與重現(xiàn)性

將不同濃度(1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mg/mL)的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按“1.3”方法處理后，進(jìn)行RP-HPLC分析，每種濃度做5個(gè)平行，不同批次做3次重復(fù)。兩種待測(cè)物3批次5次平行間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.4儲(chǔ)存條件對(duì)衍生化樣品穩(wěn)定性的影響

分別對(duì)5.00 mg/mLL-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸衍生后樣品的儲(chǔ)存溫度進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)衍生化處理后，2種氨基酸衍生化樣品分別于室溫、37 ℃和4 ℃下放置20 h后進(jìn)行RP-HPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示，以室溫放置0 h的衍生化樣品為對(duì)照(CK)，發(fā)現(xiàn)衍生化樣品于4 ℃儲(chǔ)存時(shí)的穩(wěn)定性最佳，與CK相比無顯著差異。而室溫放置20 h和37 ℃放置20 h的樣品的穩(wěn)定性較CK顯著下降(P<0.05)，說明低溫儲(chǔ)存有利于衍生化樣品的穩(wěn)定。

此外，對(duì)不同濃度衍生化樣品于4 ℃的儲(chǔ)存時(shí)間(0，12，24，48，72 h)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，不同濃度的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸在不同保存時(shí)間下的峰面積無顯著差異，說明衍生化處理的樣品在4 ℃較為穩(wěn)定，可以短時(shí)間(72 h)于4 ℃保存。

2.5微生物發(fā)酵體系中反式-4-羥基-L-脯氨酸的色譜分離及測(cè)定

圖1　氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵液樣品的色譜圖Fig.1　Chromatograms of amino acids standard and fermented liquid samplesa：L-Pro and trans-Hyp standard；b：L-Pro in LB mediun without inoculation of bacterium；c：co-culture with L-Pro biotransforming bacteriumwhich can bioconvert L-Pro into trans-Hyp

應(yīng)用上述優(yōu)化的柱前衍生方法檢測(cè)重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系中L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵液樣品的色譜圖見圖1，由圖可見大腸桿菌發(fā)酵液中L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸獲得了良好的分離，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出剩余L-脯氨酸的濃度為0.64 mg/mL，轉(zhuǎn)化生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的濃度為1.77 mg/mL，表明此時(shí)大腸桿菌轉(zhuǎn)化L-脯氨酸為反式-4-羥基-L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率為 59.0%。

3　結(jié)　論

采用本文建立的柱前衍生反相高效液相色譜法可以準(zhǔn)確、快速、靈敏地分離并檢測(cè)重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系中的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸含量，該方法適用于微生物轉(zhuǎn)化體系中L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的分離及定量分析。

[1]Remuzon P.Tetrahedron,1996,52(44):13803-13835.

[2]Seki M,Matsumoto K.Biosci.Biotechnol.Biochem.,1995,59:1161-1162.

[3]Wichmann C F,Liesch J M,Schwartz R E.J.Antibiot.,1989,42:168-173.

[4]DeFronzo R A.Diabetes,1988,37:667-687.

[5]Baker D H.AminoAcids,2009,37:29-41.

[6]Wu G,Bazer F W,Burghardt R C,Johnson G A,Kim S W,Knabe D A,Li P,Li X L,McKnight J R,Satterfield M C,Spencer T E.AminoAcids,2011,40:1053-1063.

[7]Zhang Z Q，Zhao D X，Yang X L.AminoAcidsandBioticResources(張自強(qiáng)，趙東旭，楊新林.氨基酸和生物資源)，2006，28：55-58.

[8]Kuttan R,Panikkar B,Binitha P P.Springerplus,2015,4:546.

[9]Yi Y,Sheng H,Li Z,Ye Q.BMCBiotechnol.,2014,14:44.

[10]Falcioni F,Blamk L M,Oliver F,Andreas K,Bruno B,Schmid A.Appl.Environ.Microbiol,2013,79:3091-3100.

[11]Falcioni F,Bühler B,Schmid A.Biotechnol.Bioeng.,2015,112:322-330.

[12]Hebei Brant Pharmaceutical Co.,Ltd.Hebei Normal University.China Patent (河北博倫特藥業(yè)有限公司，河北師范大學(xué).中國專利)，103275998A.2013-09-04.

[13]Takeshi S,Hideo M,Akio O.Biosci.Biotechnol.Biochem.,2000,64:746-750.

[14]Polly Chan S W,Greaves J,Da Silva N A,Wang S W.BMCBiotechnol.,2012,12:51.

[15]Tu C Y，Zhao J，Ge J L，Wu Y Q，Tang M H，Yuan Y J，Wei P，Li S C.J.Instrum.Anal.(屠春燕，趙珺，葛佳璐，吳燕嬌，唐美華，袁艷娟，韋萍，李壽椿.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2008，27(7)：681-685.

[16]Wei X L，Ding M F，Dong Y C，Yang D Z.ChinaFeed(魏秀蓮，丁美方，董穎超，楊定忠.中國飼料)，2011，18：41-43.

Quantitative Analysis of trans-4-Hydroxy-L-proline by Microbial Conversion of L-Proline

ZHANG Hong-lei1,XU Zhi-dong1,LI Wei1，2*,YANG Yu-tao1,DU Jie1,HAN Meng-nan1,WANG Shuo-kang1

(1.College of Chemistry Environmental Science,Hebei University,Baoding071002,China;2.Heibei Brant Pharmaceutical Co.,Ltd.,Shijiazhuang052263,China)

trans-4-Hydroxy-L-proline is one of the valuable chiral building block in the production of many pharmaceuticals.A quantification method oftrans-4-hydroxy-L-proline andL-proline from microbial transformation by using reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was developed.9-Fluorenylmethyl chloroformate(FMOC-Cl) was used as pre-column derivation agent,and the derivatization was proceeded in sodium tetraborate buffer solution(pH 9.9) containing acetonitrile-water(66∶34).The solution then was separated on an Agilent Extend C-18 column by using 0.1% trifluoroacetic acid and acetonitrile as mobile phase,and detected with UV detector at 263 nm.The linear ranges of two amino acid were in the range of 0.01-5.00 mg/mL,with correlation coefficients greater than 0.999.The limits of detection(LOD) were in the range of 5.00-7.00 ng/L,and the average recoveries oftrans-4-hydroxy-L-proline andL-proline were 98.9%-102% and 97.9%-100%,respectively.This method provides an effective way to quantifyL-proline andtrans-4-hydroxy-L-proline in microorganism fermented liquid system with good reproducibility,and high precision.

pre-column derivation; RP-HPLC;trans-4-hydroxy-L-proline;L-proline; microbial conversion

2016-02-16；

2016-04-05

2014年河北省高等學(xué)校高層次人才科學(xué)研究項(xiàng)目(GCC 2014013 )；國家國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2013DFB30190)

李瑋，博士，教授，研究方向：化學(xué)合成，Tel:0312-5929009，E-mail:13731461388@139.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.020

O657.72；O629.71

A

1004-4957(2016)09-1181-04