孫稚菁 ，王　嬋，李　崇 ，張國(guó)翠 ，任國(guó)杰 ，盧熠川

(1.大連市產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)研究院，遼寧　大連　116030；2.大連標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)研究中心,遼寧　大連　116030)

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)海參中硝基呋喃代謝物前處理方案的探討

孫稚菁1，王嬋2*，李崇2，張國(guó)翠2，任國(guó)杰2，盧熠川2

(1.大連市產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)研究院，遼寧大連116030；2.大連標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)研究中心,遼寧大連116030)

利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)聯(lián)合改進(jìn)的QuEChERS建立了同時(shí)測(cè)定活海參中硝基呋喃類藥物的代謝物氨基脲、1-氨基乙內(nèi)酰脲、3-氨基-2-唑烷基酮、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮的方法。樣品經(jīng)鹽酸水解，2-硝基苯甲醛衍生，37 ℃水浴16 h，調(diào)節(jié)至pH 7.0 ～7.5，QuEChERS提取凈化，氮吹至干后，用20%乙腈水定容，經(jīng)C18色譜柱分離，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，用HPLC-MS/MS以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法的線性范圍為1.0 ～10 μg/L，4種代謝物的相關(guān)系數(shù)均不小于 0.999，檢出限和定量下限分別為0.15 μg/kg 和0.5 μg/kg，在0.5，1.0，2.0，5.0 μg/kg的加標(biāo)水平下，回收率為88.0%～109.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.8% ～11.0%。用此方法對(duì)大連地區(qū)200批海參進(jìn)行檢測(cè)，合格率為95%。該方法前處理操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，溶劑消耗量小，可作為同時(shí)分析活海參中4種硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的有效手段。

硝基呋喃代謝物；QuEChERS；海參；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲(chóng)等病原體均有殺滅作用。近年來(lái)，為提高海參幼苗成活率，防止生病，一些養(yǎng)殖戶在海參養(yǎng)殖過(guò)程中大量添加抗生素等藥物[1-2]。其中，由硝基呋喃類藥物導(dǎo)致的活海參不合格率為10%。由于硝基呋喃類藥物具有潛在的“三致”作用，歐盟1995年EC/1442/95將呋喃唑酮列為不得檢出藥物；我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2002 年發(fā)布1號(hào)、193號(hào)、235號(hào)公告明確禁止呋喃它酮、呋喃唑酮用于所有食品動(dòng)物，規(guī)定其不得檢出，在2005年的560號(hào)公告中將呋喃西林、呋喃妥因列為禁用獸藥[3]。

硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因，被攝入后在體內(nèi)極不穩(wěn)定，會(huì)很快代謝，其代謝產(chǎn)物分別為氨基脲(SEM)、1-氨基乙內(nèi)酰脲(AHD)、3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮( AMOZ)[4]。硝基呋喃及其代謝產(chǎn)物的分子式與結(jié)構(gòu)式如表1所示。Hassan等[5]建立了檢測(cè)硝呋索爾等4種硝基呋喃類藥物的LC-MS/MS方法，楊琳等[6]建立了水產(chǎn)品及其苗種中硝基呋喃代謝物的LC-MS/MS檢測(cè)方法，郭無(wú)瑕等[7]利用LC-MS/MS建立了干海參中硝基呋喃代謝物殘留量的檢測(cè)方法，楊奕、王傳現(xiàn)等[8-9]利用LC-MS/MS對(duì)蝦中的硝基呋喃進(jìn)行檢測(cè)。以上文獻(xiàn)均用鹽酸水解衍生后，固相萃取小柱凈化，但其操作繁瑣、耗時(shí)且成本較高，所以建立一種準(zhǔn)確快速的硝基呋喃藥物的檢測(cè)方法成為亟待解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)海參樣品衍生后，采用改進(jìn)的QuEChERS法進(jìn)行凈化，兼具Quick(快速)、Easy(簡(jiǎn)單)、Cheap(便宜)、Effective(高效)、Rugged(耐用)和Safe(安全)等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合HPLC-MS/MS建立了硝基呋喃代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法，并對(duì)200個(gè)活海參樣品進(jìn)行檢測(cè)，為水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物快速檢測(cè)新方法的建立提供了理論依據(jù)。

表1　硝基呋喃類藥物及其代謝物的分子式、結(jié)構(gòu)式Table 1　Molecular structure and structural formula of nitrofuran and its metabolites

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、材料試劑

Q-Trap 5500串聯(lián)四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀-配電噴霧離子源(美國(guó)AB公司)；旋渦混勻器(德國(guó)IKA公司)；離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

海參樣品均為大連地區(qū)養(yǎng)殖海參。

乙腈(色譜純，J&K公司)；甲酸(色譜純，迪馬科技公司)；Bond Elut QuEChERS萃取鹽包A(內(nèi)含4 g Na2SO4和1 g NaCl)、Bond Elut QuEChERS萃取鹽包B(內(nèi)含4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g 檸檬酸鈉、0.5 g 三水合二檸檬酸二鈉) 以及Bond Elut QuEChERS凈化管(1支15 mL離心管，內(nèi)含50 mg PSA、150 mg C18、900 mg Na2SO4)均為美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；HCl、Na3PO4、NaOH(分析純，科密歐試劑有限公司)；2-硝基苯甲醛(純度為98%，百靈威科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)樣品：AOZ、SEM(純度≥99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH)，AMOZ、AHD(純度≥99%，德國(guó)Wtega公司)，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)樣品D4-AOZ、D5-AMOZ、13C3-AHD和13C-15N2-SEM(純度≥99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH)。

準(zhǔn)確稱取 4 種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(精確至0.001 g)，用甲醇溶解并逐級(jí)稀釋定容至1.0 μg/mL，分別配制成 4 種硝基呋喃代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合內(nèi)標(biāo)溶液，-18 ℃避光保存，保存期6個(gè)月。

1.2實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1樣品處理及凈化將樣品攪碎搗勻，準(zhǔn)確稱取樣品4.00 g(精確至0.01 g)置于50 mL具塞離心管中，向樣品中加入0.1 μg/mL硝基呋喃代謝物混合內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，渦旋混合1 min后加入0.2 mol/L鹽酸溶液8 mL和衍生化試劑2-硝基苯甲醛0.5 mL，渦旋混合1 min后于37 ℃恒溫水浴振蕩16 h衍生。衍生后的樣品加入1 mL 0.3 mol/L Na2SO4，用2 mol/L NaOH調(diào)至pH 7.0 ～7.5，向樣品中加入10 mL乙腈，渦旋均勻后加入萃取鹽包，渦旋混勻1 min后于4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，取6 mL上清液加入凈化管中凈化，渦旋1 min后于4 ℃ 8 000 r/min 離心5 min，取5 mL上清液在40 ℃下氮?dú)獯蹈桑? mL 20%乙腈水定容，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.2.2液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件色譜柱：Agilent Poroshell 120(3.0 mm×50 mm×2.7 μm)；流動(dòng)相：A為水(含0.1%甲酸)，B為乙腈；柱溫箱：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL。梯度洗脫程序：0～0.5 min，18%B；0.5～4 min，18%～50%；4～4.5 min，50% B;4.5～7 min，50%～82% B。采用電噴霧離子源，噴霧電壓(IS)：5 500 V；霧化器壓力(GS1):50 psi(344.5 kPa)；氣簾氣壓力(CUR)：35 psi(241.3 kPa)；輔助氣壓力(GS2)：50 psi(344.5 kPa)；離子源溫度(TEM)：550 ℃。定性離子對(duì)和定量離子對(duì)等參數(shù)見(jiàn)表2。

表2　代謝衍生產(chǎn)物的分子量及質(zhì)譜參數(shù)Table 2　Molecular weight and MS parameters of nitrofurans and its metabolites

*quantitative ion

2　結(jié)果與討論

2.1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1衍生化原理及試劑的選擇硝基呋喃代謝物常用的衍生化試劑有2-硝基苯甲醛(2-NPA)[10]、2-氯苯甲醛(2-CPA)[11]、2-羥基-1-萘甲醛(2-HN)[12]等，本實(shí)驗(yàn)采用2-NPA作為衍生試劑，代謝物的親核基團(tuán)R-NH2在酸性催化環(huán)境很快游離出來(lái)與2-NBA碳?；l(fā)生化學(xué)作用[13]。4種代謝物及其相應(yīng)的衍生產(chǎn)物分別為3-[2-硝基苯(亞甲基)]-氨基-唑酮(NPAAOZ)、5-甲基嗎啉-[2-硝基苯(亞甲基)]-氨基-2-唑酮(NPAAMOZ)、[2-硝基苯(亞甲基)]-氨基脲(NPASEM)和[2-硝基苯(亞甲基)]-氨基-2-內(nèi)酰脲(NPAAHD)[14]。

2.1.2固相萃取與QuEChERS的比較 QuEChERS方法是由Anastassiades和Lehotay于2003年首先在EPRW會(huì)議提出，于2003年正式發(fā)表的用于農(nóng)產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留分析的前處理方法。由于動(dòng)物樣品中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)難以去除，可能對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生較大的干擾，因此QuEChERS 方法在獸藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用少于農(nóng)藥殘留。

傳統(tǒng)的硝基呋喃代謝物檢測(cè)方法一般選用固相萃取小柱凈化，本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的QuEChERS方法可降低時(shí)間和溶劑成本。將均質(zhì)后的樣品經(jīng)乙腈提取后，采用萃取鹽析分層，利用基質(zhì)分散萃取機(jī)理，采用PSA 、C18、無(wú)水Na2SO4與基質(zhì)中絕大部分干擾物(脂肪酸和蛋白質(zhì))結(jié)合，通過(guò)離心方式去除，從而達(dá)到凈化目的。分別采用GB/T 20752-2006[15]與改進(jìn)的QuEChERS法對(duì)海參樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，兩種前處理方法的回收率均可達(dá)到90% ～110%，且回收率差距較小，但選用固相萃取小柱操作繁瑣耗時(shí)，消耗溶劑較多，因此最終選擇改進(jìn)的QuEChERS作為前處理方法。

2.1.3QuEChERS萃取鹽包的選擇 比較了“1.1”所示的兩種萃取鹽包的萃取效率，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，鹽包A的萃取效率比鹽包B的萃取效率低5% ～17%，可能是由于MgSO4相比Na2SO4具有更大的吸水容量，能明顯減少水相，從而促進(jìn)待測(cè)物在有機(jī)相中的分配和兩相的分層。且在萃取-分配步驟中，MgSO4水合作用是一個(gè)強(qiáng)放熱過(guò)程，可使萃取液變熱，達(dá)到40 ～45 ℃，更有利于待測(cè)物從水相到有機(jī)相的轉(zhuǎn)移。在萃取液中添加檸檬酸鈉和三水合二檸檬酸二鈉緩沖鹽，也使得提取溶液保持相對(duì)穩(wěn)定的pH值。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇萃取鹽包A。

圖1　4種硝基呋喃代謝產(chǎn)物的總離子流色譜圖Fig.1　Total ion chromatogram of four kinds of nitrofuran metabolites

2.2方法驗(yàn)證

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，按“1.2.1”前處理方法制備1.0，2.0，5.0，7.0，10 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)法定量(內(nèi)標(biāo)100 μg/L) ，以分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(y) 對(duì)分析物濃度(x,μg/L) 進(jìn)行線性回歸，4種硝基呋喃類藥物的代謝物在1.0 ～10 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均不小于0.999，以3倍信噪比(S/N) 確定其檢出限均為0.15 μg/kg，以10倍信噪比確定其定量下限均為0.5 μg/kg。總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.2回收率與精密度在海參的空白基質(zhì)中分別添加4種硝基呋喃類藥物的代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.1”前處理方法進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)，通過(guò)內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)法計(jì)算平均回收率(n=6)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)，結(jié)果見(jiàn)表3。在0.5，1.0，2.0，5.0 μg/kg的加標(biāo)水平下，4種化合物的平均回收率為88.0% ～109.6%，RSD為3.8%～11.0%，當(dāng)目標(biāo)化合物的檢測(cè)值超出線性范圍時(shí)，則稀釋一定倍數(shù)使其在線性范圍內(nèi)后再進(jìn)行定量分析。

表3　4種硝基呋喃代謝產(chǎn)物的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6，%)Table 3　Average recoveries and relative standard deviations of 4 kinds of nitrofuran metabolites(n=6，%)

圖2　海參陽(yáng)性樣品的TIC圖Fig.2　TIC chromatograms of holothurian positive samples

2.3實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法對(duì)200批活海參進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，10批活海參檢出AOZ，最大檢出量為48.2 μg/kg,3批活海參檢出SEM，最大檢出量為6.40 μg/kg,另外兩種硝基呋喃代謝物均未檢出，200批活海參的合格率為95%。陽(yáng)性樣品的TIC圖見(jiàn)圖2。

3　結(jié)　論

本文采用改進(jìn)的QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS建立了硝基呋喃代謝物的分析方法，回收率為88.0%～109.6%，RSD為3.8%～11.0%，檢出限為0.15 μg/kg。用于200批活海參的檢測(cè)，合格率為95%。該方法前處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、檢出限低，可實(shí)現(xiàn)4種硝基呋喃代謝物的同時(shí)檢測(cè)，完全滿足國(guó)內(nèi)外硝基呋喃類藥物的監(jiān)控和檢測(cè)要求。

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Pretreatment Programs Discussion of Detecting Nitrofuran Metabolites Rapidly in Holothurians by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

SUN Zhi-jing1,WANG Chan2*,LI Chong2,ZHANG Guo-cui2,REN Guo-jie2,LU Yi-chuan2

(1.Dalian Inspection Research Institute of Product Quality，Dalian116030,China；2.Dalian Standard Testing Technology Research Center,Dalian116030,China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)combined with QuEChERS method was developed for the simultaneous qualitative and quantitative analyses of four metabolites of nitrofuran antibiotics,including semicarbazide(SEM),1-amino-hydantoin(AHD),3-amino-2-oxazolidinone(AOZ),5-morpholino-3-amino-2-oxazolidone(AMOZ).The samples were hydrolyzed with HCl,and derivatized with 2-nitrobenzaldehyde at 37 ℃ for 16 h.The derivative solutions were adjusted to pH 7.0-7.5.The analytes were extracted and pured by Bond Elut QuEChERS.The separation was carried out on a C18column,using acetonitrile-0.1% formic acid as mobile phase by gradient elution.The analytes were detected by tandem mass spectrometry with electrospray ionization source under multiple reaction monitoring(MRM) mode.The method showed a good linearity between peak area ratios of the analytes to the internal standard and concentration of the analytes with correlation coefficients all above 0.999 over the dynamic range of 1.0-10 μg/L.The limits of detection(LODs) and quantitation (LOQs) of four antibiotics were 0.15 μg/kg and 0.5 μg/kg,respectively.The average recoveries of all the compounds at four spiked levels of 0.5,1.0,2.0,5.0 μg/kg ranged from 88.0% to 109.6% with RSDs (n=6) of 3.8%-11.0%.This method was used to detect 200 batches of holothurian in Dalian with the passing percentage of 95%.Compared to the traditional pretreatment method,this method is more easy to operate and less solvent comsuming,and is proved to be fast and effective for the simultaneous qualitative and quantitative analyses of the metabolites of nitrofuran antibiotics in holothurian.

nitrofuran metabolites;QuEChERS;holothurian;high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

2016-03-15；

2016-04-01

王嬋，碩士，助理工程師，研究方向：食品安全色譜分析，Tel：0411-87923970，E-mail：wangachan37@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.009

O657.63;R978.1

A

1004-4957(2016)09-1127-05