駱啟聰，張　環(huán)，陳蓉珊，陳　剛，米彥軍

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361003)

?

微小RNA mir-145在乳腺癌細(xì)胞中調(diào)控Nanog的機(jī)制與功能研究

駱啟聰，張環(huán)，陳蓉珊，陳剛，米彥軍

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361003)

目的：探討mir-145在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)Nanog的調(diào)控作用及功能.方法：采用熒光定量PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系中mir-145與Nanog表達(dá)水平，利用流式細(xì)胞術(shù)比較不同乳腺癌細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞比例，懸浮培養(yǎng)瘤球并比較瘤球與貼壁細(xì)胞間mir-145、Nanog的表達(dá)差異，過表達(dá)mir-145后檢測(cè)Nanog表達(dá)水平與報(bào)告基因活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mir-145表達(dá)升高后乳腺癌干細(xì)胞比例，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mir-145表達(dá)升高后乳腺癌細(xì)胞成瘤能力.結(jié)果：T-47D細(xì)胞表達(dá)高水平的mir-145和低水平的Nanog，MDA-MB231表達(dá)低水平的mir-145和高水平的Nanog，MDA-MB231細(xì)胞乳腺癌干細(xì)胞比例高于T-47D細(xì)胞，瘤球細(xì)胞中的mir-145表達(dá)水平低于貼壁細(xì)胞，而Nanog表達(dá)水平高于貼壁細(xì)胞.過表達(dá)mir145降低Nanog表達(dá)水平與報(bào)告基因活性，降低乳腺癌干細(xì)胞比例與平板克隆形成能力.結(jié)論：mir-145能夠調(diào)控Nanog表達(dá)水平，影響乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特性.

乳腺癌；Nanog；mir-145；腫瘤干細(xì)胞

在中國癌癥已成為非常重要的公共健康問題，癌癥發(fā)病率和死亡率不斷攀升，已成為疾病死因之首.乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，已成為威脅女性健康的主要惡性腫瘤，而且乳腺癌死亡率有升高趨勢(shì)[1].經(jīng)過術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)治療后的乳腺癌，仍有約30%患者最終出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞在此過程中發(fā)揮重要作用.

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤內(nèi)部一小部分具有特殊標(biāo)記的細(xì)胞，具有自我更新、無限增殖和多向分化的能力，對(duì)常規(guī)化療藥物和放療有更強(qiáng)的耐受能力，能夠轉(zhuǎn)移、形成新的腫瘤，是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[2].腫瘤干細(xì)胞的特征包括表達(dá)多潛能基因(Oct4、Sox2、Nanog)、能夠自我更新、形成瘤球和耐藥性等[3].

多潛能基因Nanog是維持胚胎干細(xì)胞自我更新和增殖的轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4].Nanog表達(dá)水平高的乳腺癌病人預(yù)后差，可作為三陰性乳腺癌病人的預(yù)后因素[5].近年來對(duì)Nanog等多潛能基因的研究已成為熱點(diǎn)，但對(duì)Nanog等因子的調(diào)控機(jī)制研究較少.本研究通過研究miR145 在乳腺癌中對(duì)Nanog表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，為今后開發(fā)乳腺癌新的治療措施提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231、T47D購自中科院上海細(xì)胞庫，DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基、B-27、EGF、bFGF、insulin、胎牛血清購自Gibco，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與檢測(cè)試劑盒購自Qiagen，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自東洋坊.

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231、T47D在10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)皿底80% ～ 90% 時(shí)，進(jìn)行傳代，傳代時(shí)吸除培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液洗2 次，0.5 mL 0.25%胰酶進(jìn)行消化，0.5 mL完全培養(yǎng)基中和胰酶消化液后，1, 200 × g 離心4 min，棄上清，加入培養(yǎng)基吹散細(xì)胞.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將細(xì)胞接種于不同規(guī)格的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng).

1.2.2微球體培養(yǎng)

微球體培養(yǎng)富集乳腺癌干細(xì)胞參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[6,7].收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T-47D、MDA-MB231 乳腺癌細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，PBS 緩沖液洗2 次后離心并細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入瘤球培養(yǎng)基[EGF(20 ng /mL)、bFGF(10ng /mL)、胰島素(5 μg /mL)和1×B-27 的DMEM/F12 培養(yǎng)基]重懸，使細(xì)胞密度為1×103個(gè)/mL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每2日加入100μL新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至1 周時(shí)，300 × g離心5 min 收集微球體，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與感染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：T-47D細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，過夜后分別用Lip3000將質(zhì)粒DNA、miRNA mimics轉(zhuǎn)染入T-47D和MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換液.37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).轉(zhuǎn)染過程按Lipofectamine3000說明書進(jìn)行.

病毒包裝：293T細(xì)胞接種于6cm皿中，過夜后用6μg pLV-mir145質(zhì)粒、3μg pSPAX2質(zhì)粒、1μg pMD2.G質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)換液，37 ℃孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)后收集上清并測(cè)量滴度.

病毒感染：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T-47D、MDA-MB231 細(xì)胞接種于6 孔板中(10×105/孔)，用慢病毒(滴度：1.5×105～2.3×105TU/mL)感染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后，轉(zhuǎn)為完全培養(yǎng)液培養(yǎng).感染72 h 后，加入嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞.

1.2.4總RNA提取及熒光定量PCR檢測(cè)

總RNA的提?。翰捎肨rizol試劑提取，操作按照說明書進(jìn)行.

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：miRNA逆轉(zhuǎn)錄按miScript Reverse Transcription Kit說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μL，含4μLmiScript RT Buffer，1μL miScript Reverse Transcriptase Mix，1μg Total RNA.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃ 60min，95℃ 5min.mRNA基因逆轉(zhuǎn)錄按東洋坊ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書進(jìn)行.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：miRNA的檢測(cè)按miScript SYBR Green PCR Kit說明書進(jìn)行.Mir145與U6引物序列購買自北京天根生物科技有限公司.20μL體系中含10μL QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(2×)，2μL miScript Universal Primer(10×)，2μL mir145引物或U6引物，2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，40個(gè)循環(huán).mRNA的檢測(cè)按東洋坊Realtime PCR Master Mix說明書進(jìn)行.

反應(yīng)在羅氏480熒光定量PCR儀上進(jìn)行.利用儀器上自帶的系統(tǒng)軟件分析，可觀察擴(kuò)增曲線和熔解曲線，并對(duì)cDNA的含量進(jìn)行定量分析，計(jì)算樣本的△△Ct值.通過2-△△Ct方法分析基因的相對(duì)表達(dá)情況.

1.2.5報(bào)告基因檢測(cè)

以5×104細(xì)胞/孔的接種量將細(xì)胞接種于24孔板中，24h后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所需的各種DNA，包括mir145表達(dá)或抑制質(zhì)粒、熒光素酶報(bào)告基因和β-半乳糖苷酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液后，細(xì)胞用PBS洗一次，之后加100ul裂解液(50mM Tris，0.1% TritonX-100，1mM DTT，pH7.4)，4℃放置10min后，刮下，收集，13000rpm離心5min后取上清110μL).將30μL細(xì)胞裂解液與120μL β-半乳糖苷酶測(cè)定液混合，于37℃孵育至黃色出現(xiàn)為止，加入80μL 1M Na2CO3終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀410nm測(cè)吸收值，以此作為β-半乳糖苷酶的相對(duì)活性，用于內(nèi)對(duì)照，以標(biāo)定轉(zhuǎn)染效率.將70μL細(xì)胞裂解液與20μL熒光素酶檢測(cè)試劑混勻,立即用SPECTR FLUOR plus 檢測(cè)發(fā)出的熒光信號(hào).該熒光信號(hào)與相應(yīng)的β-半乳糖苷酶OD值之比標(biāo)定后的LUC相對(duì)活性.

2　結(jié)果

2.1乳腺癌細(xì)胞中mir-145表達(dá)水平與干細(xì)胞特性具有相關(guān)性

通過檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系T-47D、MDA-MB231細(xì)胞中mir-145、Nanog表達(dá)水平與乳腺癌干細(xì)胞比例(圖1)，發(fā)現(xiàn)mir-145在T-47D細(xì)胞中的表達(dá)水平是MDA-MB231細(xì)胞的3.54倍(p<0.05),而Nanog在T47D細(xì)胞中的表達(dá)水平只有MDA-MB231細(xì)胞的20%(p<0.05)(圖1 A).流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)(圖1 B )，T-47D細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞比例(0.13%)遠(yuǎn)少于MDA-MB231細(xì)胞中的乳腺癌干細(xì)胞比例(77.39%)，具有顯著性差異(p<0.01).為進(jìn)一步研究mir-145與Nanog在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)相關(guān)性，利用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)富集乳腺癌干細(xì)胞，通過熒光定量PCR檢測(cè)mir-145與Nanog的表達(dá)水平(圖1 C).相比較與貼壁細(xì)胞中的表達(dá)量，mir-145在瘤球中的表達(dá)水平均低于貼壁細(xì)胞中的表達(dá)水平，具有顯著性差異(p<0.05).

圖1　mir-145與Nanog表達(dá)相關(guān)性及與干細(xì)胞特性的關(guān)系

2.2mir-145對(duì)Nanog的調(diào)控機(jī)制

通過生物信息學(xué)工具網(wǎng)站MirTarBase檢索mir-145的靶基因，發(fā)現(xiàn)Nanog基因的3’-UTR上存在潛在的mir-145結(jié)合位點(diǎn)(圖2 A).雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示(圖2 B)，在293T細(xì)胞中，mir-145-mimics轉(zhuǎn)染組與Control組相比，mir-145過表達(dá)能夠顯著抑制包含Nanog 3’UTR 的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的活性(p< 0.05)；當(dāng)Nanog 3’UTR中的miR-145 結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，mir-145過表達(dá)對(duì)報(bào)告基因的抑制作用消失，即mir-145-mimics轉(zhuǎn)染組與Control組相比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2 B).在乳腺癌細(xì)胞T-47D中過表達(dá)mir-145 mimics后熒光定量PCR檢測(cè)Nanog表達(dá)水平， mir-145 mimics轉(zhuǎn)染組與Control組相比，mir-145 過表達(dá)進(jìn)一步降低Nanog表達(dá)水平(圖2 C).以上結(jié)果充分說明，mir-145 是通過與Nanog 基因的3’UTR 相互作用，負(fù)調(diào)控靶基因Nanog的表達(dá).

圖2　mir-145靶向調(diào)控Nanog基因表達(dá)

2.3mir-145調(diào)控Nanog影響乳腺癌干細(xì)胞特性

通過流式細(xì)胞術(shù)與平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mir-145表達(dá)水平對(duì)乳腺癌干細(xì)胞特性的影響，結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231細(xì)胞中過表達(dá)mir-145后乳腺癌干細(xì)胞群(CD24-CD44+)比例降低(圖3 A)，差異具有顯著意義(p< 0.05).平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)(圖3 B)，MDA-MB231細(xì)胞中過表達(dá)mir-145后，形成的克隆數(shù)量降低，差異具有顯著意義(p< 0.05).

圖3　mir-145影響乳腺癌干細(xì)胞特性

3　討論

Nanog作為轉(zhuǎn)錄因子在維持胚胎干細(xì)胞多潛能性過程中發(fā)揮重要作用[8]，雖然在成體組織中不表達(dá)，但在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9,10]，在乳腺癌中Nanog高表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)，激活MDR1基因表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞耐藥[11].在MCF7細(xì)胞及MDA-MB231細(xì)胞中免疫染色發(fā)現(xiàn)Nanog只在一小部分細(xì)胞中表達(dá)[12].這與腫瘤干細(xì)胞所占比例相符.研究發(fā)現(xiàn)在MCF7細(xì)胞中過表達(dá)Nanog引起乳腺癌干細(xì)胞群的擴(kuò)展[13].另外，在乳腺癌細(xì)胞中抑制Nanog引起細(xì)胞增殖減慢、克隆形成減少以及轉(zhuǎn)移能力減弱[4].最新研究發(fā)現(xiàn)采用TALEN和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除Nanog基因具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)化療敏感度的效果[14,15]，Nanog基因敲除、抑制Nanog表達(dá)及功能可單獨(dú)或協(xié)同發(fā)揮腫瘤治療性作用[16]，提示Nanog可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn).然而目前對(duì)腫瘤細(xì)胞中Nanog基因異常激活和調(diào)控的分子機(jī)制尚未完全闡明.對(duì)這些關(guān)鍵問題研究的不斷深入，將為全面揭示Nanog在腫瘤中的作用提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，同時(shí)也為腫瘤分子診斷和靶向治療提供新的思路和方法.

microRNAs 是哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的一類非編碼小分子RNA，具有重要的基因調(diào)節(jié)作用，在腫瘤干細(xì)胞中同樣發(fā)揮重要作用.我們的研究發(fā)現(xiàn)mir-145能夠調(diào)控干細(xì)胞多能基因Nanog，并體現(xiàn)為乳腺癌干細(xì)胞特性的改變，可用于乳腺癌的治療.miRNA mimic 是一種化學(xué)合成的RNA 寡核苷酸，可模擬內(nèi)源miRNA，提高細(xì)胞內(nèi)miRNA 水平，增強(qiáng)miRNA 的功能.通過將mir-145 mimics 導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞中，可能降低乳腺癌病人耐藥風(fēng)險(xiǎn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的幾率，提高患者生存率.基于脂質(zhì)體技術(shù)平臺(tái)的miRNA藥物輸送技術(shù)已進(jìn)行臨床試驗(yàn)，對(duì)實(shí)體瘤患者進(jìn)行嘗試性治療.這一技術(shù)可以使得miRNA類藥物到達(dá)人體內(nèi)部的組織.而外泌體由于其在血液中的穩(wěn)定性與靶向性，將可能成為新一代的藥物輸送平臺(tái).將mir-145包裝在外泌體中，通過外泌體膜表面的特異蛋白靶向乳腺癌干細(xì)胞，將有可能徹底消滅乳腺癌干細(xì)胞，達(dá)到完全治愈乳腺癌患者的目標(biāo).

[1]Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,(2):115-132.

[2]Yu Z, Pestell T G, Lisanti M P, et al. Cancer stem cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2012,44:2144-2151.

[3]Prud'homme G J. Cancer stem cells and novel targets for antitumor strategies[J]. Curr Pharm Des, 2012,(19):2838-2849.

[4]Han J, Zhang F, Yu M, et al. RNA interference-mediated silencing of NANOG reduces cell proliferation and induces G0/G1 cell cycle arrest in breast cancer cells[J]. Cancer Lett, 2012,(1):80-88.

[5]Nagata T, Shimada Y, Sekine S, et al. KLF4 and NANOG are prognostic biomarkers for triple-negative breast cancer[J]. Breast Cancer, 2016:1-10.

[6]Zhang F, Song C, Ma Y, et al. Effect of fibroblasts on breast cancer cell mammosphere formation and regulation of stem cell-related gene expression[J]. Int J Mol Med, 2011,(3):365-371.

[7]Feifei N, Mingzhi Z, Yanyun Z, et al. MicroRNA expression analysis of mammospheres cultured from human breast cancers[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012,(11):1937-1944.

[8]Rodda D J, Chew J L, Lim L H, et al. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2[J]. J Biol Chem, 2005,280:24731-24737.

[9]Siu M K, Wong E S, Chan H Y, et al. Overexpression of NANOG in gestational trophoblastic diseases: Effect on apoptosis, cell invasion, and clinical outcome[J]. Am J Pathol, 2008,(4):1165-1172.

[10]Jeter C R, Badeaux M, Choy G, et al. Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates human tumor development[J]. Stem Cells, 2009,(5):993-1005.

[11]Bourguignon L Y, Peyrollier K, Xia W, et al. Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker Nanog, Stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells[J]. J Biol Chem, 2008,(25):17635-17651.

[12]Ling G, Chen D, Wang B, et al. Expression of the pluripotency markers Oct3/4, Nanog and Sox2 in human breast cancer cell lines[J]. Oncol Lett, 2012,(6):1264-1268.

[13]Liao W, Liaw C, Huang Y, et al.Cyclohexylmethyl flavonoids suppress propagation of breast cancer stem cells via downregulation of NANOG[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013,2013:170261.

[14]Ding Y, Yu A, Li C, et al. TALEN-mediated Nanog disruption results in less invasiveness, more chemosensitivity and reversal of EMT in Hela cells[J]. Oncotarget,2014,(18):8393-8401.

[15]Kawamura N, Nimura K, Nagano H, et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout of NANOG and NANOGP8 decreases the malignant potential of prostate cancer cells[J]. Oncotarget, 2015,(26):22361-22374.

[16]Noh K H, Lee Y H, Jeon J H, et al. Cancer vaccination drives Nanog-dependent evolution of tumor cells toward an immune-resistant and stem-like phenotype[J]. Cancer Res, 2012, (7): 1717-1727.Mechanism and Function of mir-145 on Regulating Nanog in Breast Cancer Cells

(責(zé)任編校：晴川)

LUO Qicong, ZHANG Huan, CHEN Rongshan, CHEN Gang, MI Yanjun

(The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen Fujian 361003, China)

Objective: To investigate the mechanism and function of mir-145 on regulating Nanog in breast cancer cells．Methods: Comparing the expression levels of mir-145 and Nanog of breast cancer cells using Real-Time PCR, comparing the population of cancer stem cells via FACS assay, and culturing and detecting the expression level of mir-145 and Nanog in breast cancer sphere. Breast cancer cells were transfected with mir-145 mimic. Fluorescent quantitative PCR was used to determine mir-145 and Nanog mRNA expression and dual reporter assay was used to determine Nanog protein expression．Results: T-47D cell expressed higher level of mir-145, lower level of Nanog, and smaller population of breast cancer stem cells, while MDA-MB231 cell expressed lower level of mir-145, higher level of Nanog, and larger population of breast cancer stem cells. The mir-145 expression level was lower in sphere and Nanog was higher in sphere comparing to adherent cells. The mir-145 overexpression in breast cancer cells inhibited Nanog mRNA and protein expression and reduced the stem cell population and colony-formation ability. Conclusion: mir-145 can regulate Nanog expression and reverse stemness of breast cencer cells.

breast carcinoma; Nanog; mir-145; cancer stem cell

2016-09-13

廈門科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)：3502Z20134005).

駱啟聰(1983— )，男，福建泉州人，廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院助理研究員，博士.研究方向：腫瘤細(xì)胞生物學(xué).

Q756

A

1008-4681(2016)05-0010-04