景萌娜，姜鐵民，劉　斌，張咚咚，魏京華，王　品，李菊芳，陳歷俊,

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京 100163）

母乳和牛乳中乳脂肪球膜蛋白質(zhì)的差異分析

景萌娜1,2，姜鐵民2，劉斌2，張咚咚2，魏京華1,2，王品1,2，李菊芳2，陳歷俊1,2,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京 100163）

為比較乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）蛋白在母乳和牛乳中的差異，采用有機(jī)試劑提取法，從母乳和牛乳中提取分離出MFGM蛋白，經(jīng)皮爾斯TM去垢小柱去除十二烷基硫酸鈉后，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果根據(jù)特異性肽段匹配數(shù)不小于1篩選后，在母乳和牛乳中分別檢測(cè)到863 種和454 種蛋白，其中二者共有175 種，分別獨(dú)有688 種和279 種。將母乳中差異表達(dá)的688 種蛋白質(zhì)按PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的Gene Ontology（GO）功能注釋，這些蛋白主要是細(xì)胞部分、細(xì)胞器、細(xì)胞膜等組分，參與的生物途徑有新陳代謝過程、生物調(diào)節(jié)、刺激性反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程、再生作用等，具有催化、黏合、轉(zhuǎn)運(yùn)、酶調(diào)節(jié)等多種分子功能。另外，母乳中的這些差異蛋白參與氨酰tRNA生物合成、致病性大腸桿菌感染、脂肪酸代謝、丙酸代謝、甾體合成、酸降解等都是牛乳中的乳脂肪球膜蛋白不具有的功能。通過分析得出母乳和牛乳中的MFGM蛋白具有明顯差異，雖然有部分組成和功能的重疊，但在豐度和代謝路徑上，牛乳MFGM蛋白不能替代母乳MFGM蛋白。

乳脂肪球膜蛋白；母乳；牛乳；功能注釋；代謝途徑

嬰幼兒處于特殊生長(zhǎng)發(fā)育階段，具有特殊的營(yíng)養(yǎng)需求［1］。1998年，Lucas［2］提出了“營(yíng)養(yǎng)程序化”的概念，即發(fā)育關(guān)鍵或敏感時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)狀況將對(duì)機(jī)體各器官功能產(chǎn)生長(zhǎng)期以至終生的影響，且程序化的敏感時(shí)期可能從胎兒期和嬰兒期延伸到青少年時(shí)期。嬰幼兒的營(yíng)養(yǎng)狀況越來越受到人們的關(guān)注。

眾所周知，母乳是嬰幼兒最理想的天然食物，母乳中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育提供了能量和營(yíng)養(yǎng)需求。但是當(dāng)母乳不能滿足需求時(shí)，一般選擇嬰幼兒配方奶粉作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品，目前大部分的配方奶粉來源于牛乳［1］，嬰幼兒配方奶粉的基本原則是調(diào)節(jié)牛乳成分，使其最大程度上與母乳相似［3］。乳中的蛋白質(zhì)是主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，是嬰幼兒建造機(jī)體的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，機(jī)體的每一個(gè)細(xì)胞及所有的重要活性物質(zhì)都有蛋白質(zhì)的參與。研究［4］發(fā)現(xiàn)，牛乳和母乳具有明顯的成分差異，尤其是蛋白含量的差異，乳清蛋白與酪蛋白的比例在母乳中約為70∶30，而牛乳中約為18∶82。除此之外，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以前一直被忽視的乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）蛋白的研究正成為乳蛋白研究中的一個(gè)重要部分［5］。

MFG以一種微小的球狀存在于乳中，直徑大約為0.2～15 μm［6］，外面被一層很薄的膜所包圍，這層膜被稱為MFGM，它的橫截面直徑大約為10～20 nm。起著乳化劑的作用并阻止乳脂肪球的聚合和酶退化［7］。MFGM蛋白中含有25%～60%的蛋白質(zhì)，占乳中總蛋白含量的1%～2%［8］。MFGM蛋白雖然在乳中含量甚微，但卻具有重要的生物學(xué)意義，如抗癌作用、抗菌性和抗黏著性以及對(duì)腦脊髓炎的自身免疫作用［9-10］等，都是不容被忽視的。近年來，國(guó)內(nèi)外關(guān)于MFGM蛋白的研究越來越多，其中對(duì)牛乳、羊乳等動(dòng)物的MFGM蛋白研究較多，對(duì)母乳的MFGM蛋白國(guó)內(nèi)外已有了高度的重視，但對(duì)MFGM蛋白在母乳和牛乳中的差異分析卻很少［11-12］。本實(shí)驗(yàn)采用納升液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜對(duì)母乳和牛乳中的MFGM蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行相關(guān)生物信息分析，為嬰幼兒配方奶粉的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮牛乳、成熟期（大于6 個(gè)月）的母乳 北京三元食品股份有限公司。

蔗糖、氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二納、碳酸氫銨、甲醇、三氯甲烷（均為分析純） 北京化工廠；二硫蘇糖醇、尿素、碘代乙酰胺、胰蛋白酶、黃嘌呤氧化酶標(biāo)品、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 德國(guó)Sigma公司；甲酸、乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國(guó)Fisher Scientific公司；蒸餾水廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Bradford蛋白定量試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司；UltiMate 3000納升液相色譜儀、Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀、皮爾斯?去垢小柱、D-37520微量高速離心機(jī)、Nanodrop2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司；氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；3K-15型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；TRID2.5真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；KQ-500DE超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Advantage超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；Oasis HLB固相萃取柱 美國(guó)Waters公司。

1.3方法

1.3.1MFGM蛋白的提取

［13-16］的方法，在此基礎(chǔ)上略有改動(dòng)。分別取新鮮牛乳和母乳各8 mL，按5 g/100 mL添加蔗糖，混合均勻后，于4 ℃、4 000×g條件下離心20 min，取脂肪層，脂肪層采用PBS洗2～3 遍，得乳脂肪。向得到的乳脂肪中加入適量的超純水，混勻后5 000×g離心20 min，取脂肪層，按體積比1∶1添加三氯甲烷和甲醇，混勻后11 000×g離心20 min，取中間蛋白層，重復(fù)2 次后氮吹，得到MFGM蛋白。

1.3.2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

采用不連續(xù)電泳體系，配制體積分?jǐn)?shù)15%分離膠和體積分?jǐn)?shù)4%的濃縮膠，各取20 μL樣品加入5 μL的5 倍上樣緩沖液，沸水浴10 min后，11 000×g離心10 min，上樣體積為5 μL。以80 V恒壓預(yù)電泳30 min左右，再以120 V恒壓至電泳結(jié)束，振蕩染色1 h。脫色至背景透明，進(jìn)行凝膠成像分析，分析軟件為Alphaimager HP。

1.3.3MFGM蛋白液相色譜-質(zhì)譜分析的前處理

將得到的MFGM蛋白加入適量的SDS裂解液（0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl+4% SDS+0.1 mol/L二硫蘇糖醇），100 W超聲溶解30 min。取100 μL蛋白質(zhì)裂解液，加100 μL水混勻。采用皮爾斯TM去垢小柱去除SDS：將皮爾斯TM去垢小柱置于2 mL離心管中，于4 ℃、1 500×g離心1 min，除去儲(chǔ)存溶液；向皮爾斯?去垢小柱內(nèi)加入400 μL PBS溶液，于4 ℃、1 500×g離心1 min，棄流出液，重復(fù)1 次；將稀釋后的裂解液轉(zhuǎn)入皮爾斯?去垢小柱內(nèi)，置于室溫2 min后，于4 ℃、1 500×g離心1 min，收集流出液，采用0.05 mol/L NH4HCO3溶液將流出液稀釋至500 μL，Bradford法測(cè)定蛋白含量后，按質(zhì)量比1∶50加入1 mg/mL的胰蛋白酶，37 ℃酶解過夜。酶解液經(jīng)HLB萃取柱脫鹽后，真空冷凍干燥。干燥后加入50 μL體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液復(fù)溶，11 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析［17-18］。

1.3.4儀器測(cè)定條件

色譜條件：色譜分析柱為C18Acclaim Pep Map RSLC柱（15 cm×50 μm，2 μm，100 ?）；富集柱為C18Acclaim Pep Map 100柱（2 cm×75 μm，5 μm，100 ?）；柱溫為35 ℃；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序：體積分?jǐn)?shù)4% B保持5 min，在70 min內(nèi)B的體積分?jǐn)?shù)從4%升到50%，保持3 min，在2 min之內(nèi)B的體積分?jǐn)?shù)降低到4%并保持10 min。流速為0.25 μL/min，進(jìn)樣量1 μL［19-21］。

質(zhì)譜條件：離子源為Nanospray Flex納升電噴霧離子源；電噴霧電壓3.2 kV；離子傳輸管溫度320 ℃；射頻透鏡為50%；掃描模式為數(shù)據(jù)依賴模式；一級(jí)質(zhì)譜采用Orbitrap采集，質(zhì)量掃描范圍為m/z 300～1 600，分辨率為70 000；對(duì)豐度最高的15 個(gè)離子峰進(jìn)行二次碎片采集，碎裂模式為高能碎裂，碰撞能量為28%［22］。

1.3.5Q Exactive質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

所獲得樣品的RAW數(shù)據(jù)文件使用Thermo Proterme Discoverer 1.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索軟件使用SEQUEST HT，數(shù)據(jù)庫(kù)源自Uniprot（物種為人，Homo sapiens；物種為牛，Bos taurus）。具體參數(shù)設(shè)置：酶為胰蛋白酶（full），最大漏切位點(diǎn)設(shè)置為2，母離子質(zhì)量偏差為10 mg/mL，子離子質(zhì)量偏差為0.02 D。動(dòng)態(tài)修飾設(shè)置：氧化（Oxidation/M+15.995 D），脫氨基化（Deamidated/N,Q+0.984 D），固定修飾設(shè)置為脲甲基化（Carbamidomethyl/C+57.021 D）。比對(duì)結(jié)果使用Percolator計(jì)算q值進(jìn)行卡值［22］。采用R（3.2.0）進(jìn)行蛋白組數(shù)據(jù)分析，使用R的“l(fā)imma”包進(jìn)行韋恩圖繪制，使用“gplots”包進(jìn)行熱圖的繪制。差異蛋白的Gene Ontology（GO）功能注釋采用PANTHER在線分析平臺(tái)（http：//www.pantherdb.org/）。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路分析采用DAVID在線分析平臺(tái)（https：//david. ncifcrf.gov/tools.jsp）。

2　結(jié)果與分析

2.1SDS-PAGE結(jié)果分析

參考馬鶯等［15］的方法提取，在提取過程中用PBS溶液洗數(shù)次，以除去附著于MFGM上的酪蛋白、乳清蛋白或其他蛋白，降低所提取的MFGM蛋白中雜質(zhì)蛋白的含量。在提取離心過程中母乳和牛乳的沉淀量有所差異：第1次離心后，母乳有少量沉淀，而牛乳的沉淀卻很多；用PBS溶液洗2 次，在這個(gè)過程中，牛乳有少量幾乎看不見的沉淀，而母乳卻有明顯的沉淀。

圖1　MFGM蛋白離心提取過程中沉淀蛋白的SDS-PAGGEE圖Fig.1　SDS-PAGE patterns of MFGM proteins in centrifugal extraction process

為了說明在提取過程中母乳和牛乳中沉淀的蛋白是否需要除去，保證除去雜蛋白，而又能保留目標(biāo)蛋白，取其提取過程中前3 次離心后沉淀蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，由圖1可以看出，N1含有大量酪蛋白，有必要去除；N2含有少量酪蛋白，必要的時(shí)候可以去除；M1含有少量酪蛋白，為了不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要將其去除；M2從條帶上看已經(jīng)幾乎沒有酪蛋白及其他雜蛋白的存在，所以第1次洗后的沉淀蛋白可以不去除；M3、M4從條帶上看是沒有酪蛋白及其他雜蛋白影響的，所以可以不去除。值得注意的是，對(duì)實(shí)驗(yàn)中每次PBS溶液洗后棄去的上清液電泳分析后，會(huì)有少量的MFGM蛋白，所以實(shí)驗(yàn)中用PBS溶液洗的次數(shù)過多后會(huì)有MFGM蛋白損失。由SDSPAGE結(jié)果除了可以看出牛乳和母乳在提取過程中的差異，還可以得出在提取過程中需要用PBS溶液洗合適的次數(shù)，排除雜蛋白的干擾外，不至于損失過多MFGM蛋白，得到純度較高的MFGM蛋白。

2.2皮爾斯TM去垢小柱法樣品前處理結(jié)果

在處理MFGM蛋白樣品時(shí)，為了使MFGM上附著的蛋白充分解離，并促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)充分展開，實(shí)驗(yàn)中需要使用去垢劑將其裂解，本實(shí)驗(yàn)所使用的是SDS裂解液，但殘留的SDS會(huì)降低酶解效率、干擾肽段的色譜分離并對(duì)目標(biāo)物離子化過程產(chǎn)生強(qiáng)烈的離子抑制作用［23］，對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)生不利影響，必須將其除去。目前脫除SDS的方法中，使用較多的是Wisniewski等［24］的方法，即利用超濾管輔助樣品前處理（Filter aided proteome preparation，F(xiàn)ASP）法來脫除SDS。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，超濾管對(duì)SDS耐受度低，并且該法存在步驟繁瑣、損失過多等問題。采用皮爾斯?去垢小柱通過簡(jiǎn)單操作，可以很好的去除SDS。曹曉琳等［17］將該新型親和小柱用于水稻蛋白質(zhì)樣品的凈化中，并對(duì)比了傳統(tǒng)的FASP法、丙酮沉淀法和皮爾斯TM去垢小柱法對(duì)SDS的去除效果，參考文獻(xiàn)結(jié)果，以5 mL的牛乳為樣品做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，提取MFGM蛋白后，運(yùn)用FASP法和皮爾斯TM去垢小柱法2 種前處理方法，經(jīng)NanoLC-Orbitrap質(zhì)譜對(duì)提取蛋白分析，F(xiàn)ASP法識(shí)別出的354 種蛋白質(zhì)；皮爾斯TM去垢小柱法識(shí)別出568 種蛋白質(zhì)，是FASP法的1.6 倍。由此可知，皮爾斯去垢小柱法不但操作簡(jiǎn)單，而且具有更高的提取率。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用操作簡(jiǎn)單且結(jié)果較好的皮爾斯?去垢小柱法對(duì)8 mL的牛乳和母乳成熟乳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品2 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2.3Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀檢測(cè)結(jié)果

將提取的母乳和牛乳蛋白樣品經(jīng)過皮爾斯TM去垢小柱法前處理后，采用納升液相色譜-串聯(lián)Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀檢測(cè)，將得到的RAW源文件進(jìn)行SEQUEST HT比對(duì)。在牛乳的2 個(gè)平行樣品中分別檢測(cè)到了579 種和525 種蛋白質(zhì)，母乳的2 個(gè)平行樣品中分別檢測(cè)到了1 254 種和1 215 種蛋白質(zhì)，母乳中所檢測(cè)到的蛋白種類約是牛乳中的2.2 倍。其中，選取穩(wěn)定檢測(cè)到的蛋白進(jìn)行下一步的分析。

對(duì)于母乳和牛乳來說，首先選取樣品中unique peptide大于1的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析；其次，為了方便不同物種間蛋白的比較，以蛋白u(yù)niprot標(biāo)準(zhǔn)名稱為索引，選擇母乳樣品和牛乳樣品中共有的蛋白進(jìn)行后續(xù)的分析。

2.3.1母乳和牛乳質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比分析

為了從整體上對(duì)母乳和牛乳蛋白樣品的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)母乳和牛乳樣品結(jié)果進(jìn)行盒形圖分析，如圖2A所示。盒形圖顯示在母乳H1、H2和牛乳B1、B22 個(gè)平行樣品中，蛋白豐度（log2轉(zhuǎn)換）的分布情況。可以看到，首先，牛乳和母乳2 個(gè)平行樣品的重復(fù)性較好，說明前處理過程和儀器分析的誤差小，結(jié)果較為可靠，可用于后續(xù)分析。其次，整體來說，母乳中蛋白豐度的中位數(shù)要高于牛乳蛋白豐度的中位數(shù)，可以說明母乳中的MFGM蛋白含量明顯比牛乳中的高。

進(jìn)一步比較母乳和牛乳中的MFGM蛋白的差異，如圖2B所示（經(jīng)過unique peptide不小于1篩選），母乳和牛乳中分別檢測(cè)到863 種和454 種蛋白，其中二者共有175 種，分別獨(dú)有688 種和279 種，母乳中差異蛋白數(shù)量約為牛乳的2 倍。

圖2　2組MFGM蛋白的盒形圖（A）和韋恩圖（B）Fig.2　Venn diagrams of two groups of MFGM proteins

進(jìn)一步對(duì)母乳和牛乳中共有的175 種蛋白的豐度情況進(jìn)行層次聚類分析和熱圖展示，以對(duì)這些蛋白在母乳和牛乳中的豐度進(jìn)行整體性的概覽，如圖3所示。絕大部分蛋白在母乳中含量均高于牛乳，如Clusterin等，而其余少數(shù)蛋白則是在牛乳中的豐度高于母乳，如protein S100-A8、Musin-15等。個(gè)別蛋白在2 種乳品中沒有明顯差異，如Butyrophilin subfamily 1 member A1等。

圖3　2組MFGM蛋白的聚類熱圖Fig.3　Clustering and heat maps of two groups of MFGM proteins

雖然母乳和牛乳中MFGM有差異，但是2 種樣品中均含有豐度相對(duì)較高且有顯著生理功能的幾種蛋白：黃嘌呤脫氫酶/氧化酶、嗜乳脂蛋白、組織糖蛋白高碘酸稀爾6/7、脂肪酸結(jié)合蛋白、血小板糖蛋白4、黏蛋白-1和脂滴包被蛋白等［14,25］。為此，將母乳和牛乳的這幾種蛋白的面積值進(jìn)行對(duì)比分析，從表1可以看出，7 種主要蛋白的面積均值均不相同，除脂肪酸結(jié)合蛋白在牛乳中較大外，其他蛋白均在母乳中較大，有的蛋白的面積值甚至大出了幾倍。從這些較高豐度蛋白在一定程度上可以反映出與母乳相比，牛乳的MFGM蛋白還是有一定差距的。

表1　乳中7種MFGM蛋白Table1　Seven milk fat globule membrane proteins in breast milk andbovine milk

2.3.2差異蛋白的GO注釋分析

對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的研究有助于提高對(duì)乳中蛋白的認(rèn)識(shí)和利用［5］。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)母乳和牛乳中MFGM蛋白的差異，以牛乳為本體，將母乳中差異表達(dá)的688 種MFGM蛋白按PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的GO注釋，分別對(duì)其細(xì)胞成分、生物途徑以及分子功能3 個(gè)方面的信息進(jìn)行歸類［21］。如圖4所示，在母乳中MFGM的差異表達(dá)蛋白中，41.6%的是細(xì)胞部分、24.3%的是細(xì)胞器、16.0%的是高分子復(fù)合物、10.3%的是膜以及少量的胞外區(qū)以及細(xì)胞外基質(zhì)；差異表達(dá)蛋白參與了很多生物途徑，其中有32.2%的蛋白參與代謝過程，19.8%的蛋白參與細(xì)胞過程，10.7%的蛋白參與定位過程，其余蛋白分別參與了生物調(diào)節(jié)、發(fā)展歷程、刺激性反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程、凋亡過程、再生作用等，母乳中這些差異蛋白的分子功能主要是催化活性和黏性，分別占蛋白的38.4%和30.6%，還有結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、受體活性、抗氧化劑活性等多個(gè)分子功能。同樣，將牛乳中的MFGM蛋白依據(jù)PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的GO注釋，分析其細(xì)胞成分、生物途徑和分子功能3 個(gè)方面的信息，都與母乳中的這些差異蛋白有很多重疊，但是3 個(gè)部分所占比例不同，所以，牛乳中MFGM蛋白某些功能和母乳是一樣的，但是由于生物體的差異，其含量是不同的。

2.3.3差異蛋白的KEGG代謝路徑分析

為了更進(jìn)一步的了解母乳和牛乳MFGM蛋白中差異蛋白的代謝路徑，以牛乳為本體，采用DAVID在線分析平臺(tái)對(duì)母乳中具有差異表達(dá)的688 種MFGM蛋白進(jìn)行KEGG代謝路徑分析，結(jié)果有461 種蛋白被識(shí)別，其中有44.7%的蛋白（即206 種）有代謝路徑信息，其中每個(gè)路徑中蛋白數(shù)大于2的有31.2%即144 種，共有19 個(gè)代謝路徑，除去與牛乳中代謝路徑重疊的核糖體、糖酵解途徑、過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路、丙酮酸代謝等路徑外，其余差異蛋白參與的路徑如圖5所示，包括：氨酰tRNA生物合成、致病性大腸桿菌感染、脂肪酸代謝、丙酸代謝、甾體合成、酸降解等。結(jié)果表明，母乳中MFGM蛋白參與的代謝路徑較牛乳中MFGM蛋白多。牛乳中MFGM蛋白在某些代謝途徑上還是無法達(dá)到母乳中MFGM蛋白的功能特性。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分別以8 mL的母乳成熟乳和牛乳為原料經(jīng)有機(jī)試劑提取后，采用皮爾斯?去垢小柱法前處理，采用NanoLC-Orbitrap質(zhì)譜對(duì)牛乳中的MFGM蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，并進(jìn)行相關(guān)生物信息分析。

通過SDS-PAGE分析提取母乳和牛乳的MFGM蛋白過程中的差異，結(jié)果表明母乳和牛乳的MFGM蛋白提取過程具有很大差別，所以要根據(jù)不同的乳源進(jìn)行不同的提取，以便達(dá)到實(shí)驗(yàn)所要求的純度而又達(dá)到較高的產(chǎn)率；采用皮爾斯?去垢小柱法進(jìn)行樣品前處理，運(yùn)用簡(jiǎn)單的操作可以很好地去除SDS，避免了運(yùn)用FASP法中樣品的損失；通過高分辨質(zhì)譜儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)母乳所檢測(cè)到的MFGM蛋白種類約是牛乳種類的2.2 倍；利用盒形圖、熱圖聚類、韋恩圖，從種類和豐度上直觀的對(duì)比了母乳和牛乳的差異，顯示出與牛乳MFGM蛋白相比，母乳中的MFGM蛋白不但種類多而且豐度高；以牛乳為本體，對(duì)母乳中特有的MFGM差異蛋白做GO注釋，與牛乳中MFGM蛋白功能相比，細(xì)胞成分、生物途徑以及分子功能3 個(gè)方面的信息有很多重疊，從GO注釋的結(jié)果對(duì)比來看，與母乳相比牛乳中的MFGM蛋白在功能方面可以起到一定的作用；通過KEGG代謝通路比較，母乳中具有差異表達(dá)的MFGM蛋白參與的代謝途徑雖然和牛乳中只有少部分重疊，氨酰tRNA生物合成、致病性大腸桿菌感染、脂肪酸代謝、丙酸代謝、甾體合成、酸降解等這些途徑是母乳中MFGM蛋白所參與的，所以牛乳MFGM蛋白還是與母乳MFGM蛋白有一定差距。

通過以上結(jié)果可以看出，MFGM蛋白在母乳和牛乳中具有明顯差異，其中雖然有部分組成和功能重疊，但是在豐度和代謝路徑上，牛乳MFGM蛋白并不能替代母乳MFGM蛋白。目前嬰幼兒配方粉的研究主要關(guān)注在幾種主要蛋白含量的差異、乳脂肪的差異、微量元素的添加和其他一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加［1］，而隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，MFGM蛋白在母乳和牛乳中的差異也得以進(jìn)行深入研究，這對(duì)開發(fā)含MFGM蛋白的嬰幼兒配方奶粉具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 龐彩霞. 嬰兒配方乳研究現(xiàn)狀［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊）, 2008（11）： 66-68. DOI：10.3969/j.issn.1671-9646-B.2007.11.020.

［2］ LUCAS A. Programming by early nutrition： an experimental approach［J］. Journal of Nutrition, 1998, 128（Suppl 2）： 401S-406S.

［3］ 田建軍, 張開屏, 李國(guó)君, 等. 嬰幼兒配方奶粉的研究方法［J］. 中國(guó)供銷商情（乳業(yè)導(dǎo)刊）, 2005（8）： 31-34.

［4］ 柏丹丹. 母乳營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定［D］. 蘇州： 蘇州大學(xué), 2013.

［5］ 蘆晶, 劉鷺, 張書文, 等. 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在乳品研究中的應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2013, 3（6）： 385-388. DOI：10.3969/ j.issn.2095-2341.2013.06.01.

［6］ MARIE-CAROLINE M, MICHEL O, VALéRIE B, et al. Native fat globules of different sizes selected from raw milk： thermal and structural behavior［J］. Chemistry and Physics of Lipids, 2004, 132（2）：247-261. DOI：10.1016/j.chemphyslip.2004.08.007.

［7］ DEWETTINCK K, ROMBAUT R, THIENPONT N, et al. Nutritional and technological aspects of milk fat globule me mbrane material［J］. International Dairy Journal, 2008, 18（5）： 436-457. DOI：10.1016/ j.idairyj.2007.10.014.

［8］ MATHER I H. A review and proposed nomenclature for major proteins of the milk-fat globule membrane1, 2［J］. Journal of Dairy Science, 2000, 83（2）： 203-247. DOI：10.3168/jds.S0022-0302（00）74870-3.

［9］ SPITSBERG V L, GOREWIT R C. Isolation, purification and characterization of fatty-acid-binding protein from milk fat globule membrane： effect of bovine growth hormone treatment［J］. Pakistan Journal of Nutrition, 2002. DOI：10.3923/pjn.2002.43.48.

［10］ NEWBURG D S. Human-milk lactadherin in protection against rotavirus［J］. Lancet, 1998, 351： 1815-1816. DOI：10.1016/S0140-6736（05）78783-3.

［11］ CEBO C, CAILLAT H, BOUV IER F, et al. Major proteins of the goat milk fat globule membrane［J］. Journal of Dairy Science, 2010, 93（3）：868- 876. DOI：10.3168/jds.2009-2638.

［12］ PISANU S, GHISAURA S, PAGNOZZI D, et al. The sheep milk fat globule membrane proteome［J］. Journal of Proteomics, 2011, 74（3）：350-358. DOI：10.1016/j.jprot.2010.11.011.

［13］ 何勝華, 馬鶯, 崔艷華, 等. 牦 牛乳脂肪球膜組成分析及蛋白熱穩(wěn)定性［J］. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 44（10）： 104-108.

［14］ 隋順超. 對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆牛乳脂肪球膜蛋白質(zhì)及四種牛奶蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

［15］ 馬鶯, 姬曉曦, 李琳. 一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法： 中國(guó), CN 102863526 A［P］. 2013-01-09.

［16］ AFFOLTER M, GRASS L, VANROBAEYS F, et al. Qualitative and quantitative profiling of the bovine milk fat globule membrane proteome［J］. Journal of Proteomics, 2010, 73（6）： 1079-1088. DOI：10.1016/j.jprot.2009.11.008.

［17］ 曹曉林, 鞏佳第, 陳銘學(xué), 等. 新型親和去垢小柱凈化-液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法分析水稻葉片蛋白質(zhì)組［J］. 色譜, 2014, 32（11）： 1181-1186. DOI：10.3724/SP.J.1123.2014.06035.

［18］ ANTHARAVALLY B S, MALLIA K A, ROSENBLATT M M, et al. Effi cient removal of detergents from proteins and peptides in a spin column format［J］. Analytical Biochemistry, 2011, 416（1）： 39-44. DOI：10.1016/j.ab.2011.05.013.

［19］ 陳達(dá)煒, 高潔, 呂冰, 等. 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法快速篩查土豆中的多種農(nóng)藥殘留［J］. 分析化學(xué), 2014, 42（4）： 579-584. DOI：10.3724/SP.J.1096.2014. 30989.

［20］ 安卓玲, 史忱, 趙瑞, 等. 基于超高效液相色譜-質(zhì)譜的藥物性肝損傷患者血清代謝組學(xué)研究［J］. 分析化學(xué), 2015, 43（9）： 1408-1414. DOI：10.11895/j.issn.0253-3820.150261.

［21］ 黃宇, 馮晶, 饒力群, 等. 質(zhì)譜非標(biāo)記定量分析小麥抗條銹病近等基因系蛋白質(zhì)變化［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2014, 15（6）： 88-95.

［22］ ZHANG W, GU P, JIANG Z, et al. The o ne hour proteome： Q-OT-qIT mass spectrometry based rapid proteome identifi cation［J］. Scientia Sinica Vitae, 2014, 44（5）： 528-536. DOI：10.1360/05201 4-16.

［23］ ALESSANDRO T, GRAZIA B, DANIELA P, et al. Comparison of detergent-based sample preparation workflows for LTQ-Orbitrap analysis of the Escherichia coli proteome［J］. Proteomics, 2013, 13（17）：2597-2607. DOI：10.1002/pmic.201200478.

［24］ WISNIEWSKI J R, ZOUGMAN A, NAGARAJ N, et al. Universal sample preparation method for proteome analysis［J］. Nature Methods, 2009, 6（5）： 359-362. DOI：10.1038/nmeth.1322.

［25］ 何勝華, 李海梅, 馬鶯. 乳脂肪球膜（MFGM）的組成及生理特性［J］.中國(guó)乳品工業(yè) , 2009, 37（4）： 38-41.

Analysis of Differences in Milk Fat Globule Membrane Proteins between Breast Milk and Bovine Milk

JING Mengna1,2, JIANG Tiemin2, LIU Bin2, ZHANG Dongdong2, WEI Jinghua1,2, WANG Pin1,2, LI Jufang2, CHEN Lijun1,2,*
（1. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2. National Maternal and Infant Health Dairy Researching Center, Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd., Beijing 100163, China）

In order to compare the difference in milk fat globule membrane （MFGM） proteins between breast milk and bovine milk, MFGM were extracted from milk by organic solvent extraction and lysed in SDS-containing lysis buffer for analysis by liquid chromatography and mass spectrometry （LC-MS） after the removal of SDS using PierceTMdetergent removal spin column. The results were filtered according to the number of unique peptide ≥ 1. A total of 863 and 454 proteins were identifi ed separately in breast milk and bovine milk, including 175 proteins in common, and 688 and 279 proteins unique for breast milk and bovine milk, respectively. Gene Ontology （GO） analysis of 688 specifi c MFGM proteins in human milk showed that they were mainly distributed in cell part, cell organelle, and cell membrane, and involved in biological pathways such as metabolic processes, biological regulation, response to stimulus, immune system process, reproduction, and so on. These proteins also participated in many molecular functions, such as catalytic activity, binding, transport activity and enzyme regulation activity. In addition, these breast milk MFGM proteins were involved in some metabolic pathways, such as aminoacyl-tRNA biosynthesis, pathogenic Escherichia coli infection, fatty acid metabolism, propanoate metabolism, steroid biosynthesis, lysine degradation, which were not shown in bovine milk. The MFGM proteins in breast milk and bovine milk had obvious differences. Although some compositions and functions were overlapped, in terms of abundance and metabolic pathways, the MFGM proteins in bovine milk could not be replaced by those in breast milk.

milk fat globule membrane proteins； breast milk； bovine milk； functional annotation； metabolic pathway

10.7506/spkx1002-6630-201620012

TS252.1

A

1002-6630（2016）20-0069-06

景萌娜, 姜鐵民, 劉斌, 等. 母乳和牛乳中乳脂肪球膜蛋白質(zhì)的差異分析［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 69-74.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620012. http：//www.spkx.net.cn

JING Mengna, JIANG Tiemin, LIU Bin, et al. Analysis of differences in milk fat globule membrane proteins between breast milk and bovine milk［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 69-74. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620012. http：//www.spkx.net.cn

2016-01-13

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（D141100004814001）

景萌娜（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵乳制品。E-mail：479560904@qq.com

陳歷俊（1967—），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：chenlijun@sanyuan.com.cn