王寅，謝金萍，梁晶晶

（1.山東省計量科學(xué)研究院，山東濟南250014；2.青島根源生物技術(shù)集團有限公司，山東青島266061）

四株單菌及其復(fù)配后復(fù)合菌劑凈水效果初步研究

王寅1，謝金萍2，梁晶晶2

（1.山東省計量科學(xué)研究院，山東濟南250014；2.青島根源生物技術(shù)集團有限公司，山東青島266061）

本研究對目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的枯草（Bacillus subtilis，Bs）、蠟樣（Bacillus cereus，Bc）、地衣（Bacillus licheniformis，Bl）三株芽孢桿菌和一株糞鏈球菌（Fecal streptococcus，F(xiàn)s）進行凈水效果初步比較，主要指降解氨氮、亞硝酸鹽能力的比較。將菌粉定量添加到自配的模擬污水培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，不加菌的模擬污水培養(yǎng)基作為對照。結(jié)果表明：枯草芽孢桿菌的降氨氮能力優(yōu)于其他三種菌，5 d后氨氮去除率100%，蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和糞鏈球菌也均有一定的降解氨氮能力。降亞硝酸鹽效果最好的單菌仍是枯草芽孢桿菌，亞硝酸鹽去除率第二天為85.60%，第三天為100%。地衣芽孢桿菌和糞鏈球菌降亞硝酸鹽的能力也很好，在第五天亞硝酸鹽濃度基本為0。而蠟樣芽孢桿菌降亞硝酸鹽的效果不如其他3種菌，五天后降解率僅為61.10%。根據(jù)單株菌凈水效果的結(jié)果，做菌種復(fù)配凈水試驗。共得出七種配方復(fù)合菌劑，同樣在模擬污水培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。結(jié)果得出，配方E為最優(yōu)配方，第三天氨氮去除率為81.33%，第六天時去除率達到93.58%，第五天時亞硝態(tài)氮基本降為0，凈水效果突出。

芽孢桿菌；氨氮降解；亞硝酸鹽降解；復(fù)合菌劑

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，集約化養(yǎng)殖程度的不斷提高，水產(chǎn)養(yǎng)殖池的富營養(yǎng)化程度越來越高（林斌等，1994）。有機物的大量投放使殘餌、魚蝦的排泄物等富營養(yǎng)因子共存于一個水體，加上池塘自凈與調(diào)節(jié)能力的降低，營養(yǎng)水體中化學(xué)需氧量（COD）、生物耗氧量（BOD）、氨氮、硝酸鹽與亞硝酸鹽、硫化物等指標(biāo)嚴(yán)重超標(biāo)，池塘水質(zhì)惡化，魚蝦病害頻頻發(fā)生（單志欣，2000；鐘碩良等，1997）。

抗生素在養(yǎng)殖池中的過量或頻繁使用不僅會使細菌耐藥性增加，破壞和干擾養(yǎng)殖環(huán)境的正常生物系統(tǒng)，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中微生物的生態(tài)失調(diào)，而且會產(chǎn)生二重污染，在生物體內(nèi)殘留，嚴(yán)重影響水產(chǎn)品的品質(zhì)（Boyd，1999；王雷等，1994）。

如果能有效避免有機物質(zhì)及其分解產(chǎn)物的過量積累，就能獲得良好的水質(zhì)條件。正是基于這一原理，選育和培養(yǎng)高效安全的微生物菌劑，通過生物直投法凈水新技術(shù)直接投放到受污染的水體中，就能改善和恢復(fù)養(yǎng)殖水體的生態(tài)環(huán)境，減少魚蝦疾病的發(fā)生，達到凈水的目的（梁運祥等，2003）。各種芽孢桿菌尤其是枯草芽孢桿菌是微生態(tài)制劑的優(yōu)勢菌，能迅速分解水體中的有機物，促進硫化物和亞硝酸鹽的氧化，并且具有快速的生長繁殖能力和適應(yīng)環(huán)境的能力。熊偉等（2003）在海南斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖池中使用枯草芽孢桿菌制劑后，養(yǎng)殖池中的有害物質(zhì)如亞硝酸鹽、硫化氫顯著減少，COD較對照池大幅度下降。本研究以三種芽孢桿菌和一種糞鏈球菌的單菌及其復(fù)合菌劑對模擬污水中氨氮、亞硝態(tài)氮的降解能力進行考察。

1　材料與方法

1.1供試菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、糞鏈球菌（fecal streptococcus）。

1.2培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂17 g/L，pH 7.2。121℃高壓滅菌30 min。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫-80 1 g/L，七水硫酸鎂0.58 g/L，四水硫酸錳0.25 g/L，碳酸鈣5 g/L，瓊脂20 g/L。116℃高壓滅菌30 min。

模擬污水培養(yǎng)液Ⅰ：葡萄糖0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.1 g/L，硫酸鎂晶體0.05 g/L，硫酸銨0.04 g/L，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 ug/mL）12 mL/L。調(diào)pH為7.0，116℃高壓滅菌30 min。

模擬污水培養(yǎng)液Ⅱ：葡萄糖0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.1 g/L，硫酸鎂晶體0.05 g/L，硫酸銨0.04 g/L，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 ug/mL）10 mL/L。調(diào)pH為7.0，116℃高壓滅菌30 min。

1.3菌種復(fù)配方案將枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和糞鏈球菌4株菌的菌粉先進行菌量計數(shù)，再按一定比例復(fù)配使總菌量為200億/g，以滑石粉作載體。不同配方中各種菌的添加比例如表1所示。

表1　不同配方中各種菌的添加量

1.4接種量用涂布法在營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上將枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的菌粉分別計數(shù)，用傾注法以MRS培養(yǎng)基計出糞鏈球菌菌粉的菌量。根據(jù)產(chǎn)品實際使用量設(shè)定接種量為107CFU/L。

1.5測定項目及方法氨氮檢測方法：奈氏試劑法；亞硝態(tài)氮檢測方法：分光光度法（GB 7493-87）；氨氮、亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1和圖2。

圖1　氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.6試驗方案

1.6.1單菌凈水方案試驗共分五組，枯草芽孢桿菌組（Bs）、蠟樣芽孢桿菌組（Bc）、地衣芽孢桿菌組（Bl）、糞鏈球菌組（Fs）和對照組（D）。每組3個平行，共15個500 mL三角瓶。每個三角瓶內(nèi)加入150 mL的模擬污水培養(yǎng)液Ⅰ，116℃高壓滅菌30 min。再分別稱取0.1g菌粉到具玻璃珠的100 mL滅菌水中，放搖床內(nèi)搖勻。根據(jù)實際菌量算出各菌種的添加量，分別加入各試驗組，對照組不加菌。最后28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。每天或每兩天取樣，離心檢測。

1.6.2配方凈水方案試驗分兩次進行，每次四個試驗組，一個對照組。第一次試驗組為方案A、B、C、D，第二次試驗組為方案A、E、F、G。每組3個平行，共15個500 mL三角瓶。每個三角瓶內(nèi)加入150 mL的模擬污水培養(yǎng)液Ⅱ，116℃高壓滅菌30 min。再稱取0.1 g復(fù)合菌劑到具玻璃珠的100 mL滅菌水中，放搖床內(nèi)搖勻。根據(jù)實際菌量算出各配方的添加量，分別加入各試驗組。最后28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。每天取樣，離心檢測。

2　結(jié)果及分析

2.1單菌凈水結(jié)果

2.1.1不同菌株降氨氮效果由圖3可見，四株菌對氨氮均有降解作用。1 d時各組氨氮降低均不明顯。在第2 d時各試驗組均有降低，Bs、Bc、Bl氨氮去除率均在10%以上，而Fs的氨氮去除率很低。第三天時Bs的氨氮去除率最高，達到78.8%，Bc、Bl、Fs的氨氮去除率均在36%左右。第五天時Bs的氨氮去除率達到100%，F(xiàn)s的氨氮去除率繼續(xù)升高，為54.28%，而Bc、Bl組的氨氮濃度有所升高。第六天Bs氨氮濃度仍然是0，F(xiàn)s的氨氮去除率達到73.52%，Bc氨氮濃度基本維持不變，Bl氨氮濃度仍有升高。綜合來看，Bs的降氨氮效果最好，第五天就能完全去除。Fs的氨氮降解效果也很明顯，只是作用時間比Bs要晚。而Bc和Bl有一定降氨氮能力，但效果不突出。

圖3　不同菌株降氨氮效果比較

2.1.2不同菌株降亞硝態(tài)氮效果由圖4可見，四株菌對亞硝態(tài)氮均有降解作用。Bs在第二天時亞硝態(tài)氮去除率已達到85.60%，第三天時亞硝態(tài)氮濃度幾乎為零，去除率高達100%。Bl在前三天時氨氮濃度緩慢降低，在第五天亞硝態(tài)氮濃度降為零。Fs在前三天亞硝態(tài)氮濃度基本維持不變，在第五天時亞硝態(tài)氮濃度降為零。Bc在6 d檢測時間內(nèi)亞硝態(tài)氮濃度一直在降，第六天時亞硝態(tài)氮去除率達到61.10%。綜合來看，四株菌都有降亞硝態(tài)氮的功能。Bs降亞硝態(tài)氮效率明顯要高于其他菌。Bl、Fs的降亞硝態(tài)氮效果也很好，第五天時就能完全去除。與其他菌相比，Bc對亞硝態(tài)氮起作用的速度慢，且去除率也低。

圖4　不同菌株降亞硝態(tài)氮效果對比

2.2配方凈水效果

2.2.1配方A、B、C、D降氨氮、亞硝態(tài)氮效果比較由圖5可見，各配方在24 h內(nèi)氨氮濃度均有升高，對照組也有升高。在48 h以后配方A、B、C、D組均使氨氮濃度持續(xù)降低，而對照組仍在升高，3 d后對照組也開始降低?？梢姡鞣N配方均有降氨氮能力。其中配方A的降氨氮能力更強，在第五天氨氮去除率達到58.7%。各配方降氨氮能力排序為A＞C＞D＞B。

圖5　配方A、B、C、D降氨氮試驗結(jié)果

由圖6可見，各配方對亞硝態(tài)氮也均有降解功能。在第五天時所有試驗組亞硝態(tài)氮基本檢測不到。其中A配方在第二天時亞硝態(tài)氮去除率為92.4%，第四天去除率為100%。所有配方中A配方的降亞硝態(tài)氮能力最強，其他依次為B、D、C。第四天時對照組亞硝態(tài)氮濃度不再升高且有所降低可能與染菌有關(guān)。

圖6　配方A、B、C、D降亞硝態(tài)氮試驗結(jié)果

2.2.2配方A、E、F、G降氨氮、亞硝態(tài)氮效果比較由圖7可見，配方E、F、G、A都有降氨氮的能力。配方E降氨氮能力最好，第三天氨氮去除率為81.33%，第六天時去除率達到93.58%。其他三個配方效果要略差于E，依次是F、G、A。

圖7　配方A、E、F、G降氨氮效果

如圖8所示，各配方均有降亞硝態(tài)氮的功效，配方G降亞硝態(tài)氮速度最快，第三天時亞硝態(tài)氮濃度降為0。其他三個配方第五天時亞硝態(tài)氮才基本降沒。

圖8　配方A、E、F、G降亞硝酸鹽效果比較

由第一次試驗可以得出，A配方的降氨氮、亞硝態(tài)氮能力明顯優(yōu)于B、C、D配方。從第二次試驗得出E配方去除氨氮和亞硝態(tài)氮的能力要優(yōu)于F配方和A配方。G配方與其他配方比雖然降亞硝態(tài)氮能力突出但降氨氮能力較差。綜合考慮，E配方為最優(yōu)配方。

3　討論與結(jié)論

研究表明，具有高效降氮能力的細菌既有自養(yǎng)型細菌硝化細菌、光合細菌等，也有惡臭假單胞菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌等異養(yǎng)型細菌（王瑞君和魏銀萍，2005；丁雷和趙德炳，2001）。芽孢桿菌因為具有穩(wěn)定性好、抗性強、耐高溫、耐酸堿、產(chǎn)酶豐富、抑制病原菌繁殖、促進動物營養(yǎng)的消化吸收、分解有機污染物、凈化水質(zhì)等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中，其中枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較多的菌株，這2種芽孢桿菌被農(nóng)業(yè)部列為安全使用菌株。

目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用最廣的是復(fù)合菌劑。復(fù)合菌劑是基于微生態(tài)學(xué)理論，利用微生物菌群的聯(lián)合作用，由兩種或兩種以上有益的且互不拮抗的微生物菌種制備的活菌制劑。水產(chǎn)養(yǎng)殖中被污染水體是一個多重污染、多變的環(huán)境，單一的微生物只能解決其中一個或者部分問題，而符合的微生物菌群更加復(fù)合天然的微生態(tài)系統(tǒng)，較單菌表現(xiàn)出更優(yōu)的凈化和修復(fù)效能，如外國開發(fā)的EM制劑、CBM制劑、BZT微生物制劑等一些復(fù)合菌劑。

本試驗對水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見的四株單菌做水質(zhì)凈化效果比較，其中枯草芽孢桿菌降氨氮和亞硝態(tài)氮的性能最好。再用四種菌制成不同含量的復(fù)合菌劑，對其進行凈水效果驗證，得出最優(yōu)的凈化水質(zhì)配方，形成有效產(chǎn)品。

［1］丁雷，趙德炳.光合細菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究與進展［J］.水利漁業(yè)，2001，21（1）：23～25.

［2］林斌，黃凌風(fēng)，沈國英.對蝦養(yǎng)殖池水質(zhì)富營養(yǎng)化程度的初步研究［J］.廈門大學(xué)學(xué)報，1994，33（6）：863～867.

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［4］單志欣.養(yǎng)殖水質(zhì)分析及控制（三）.化學(xué)需氧量［J］.齊魯漁業(yè)，2000，17（1）：38.

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The present study was carried out to investigate the effect of four probiotic strains including Bacillus subtilis，Bacillus cereus，Bacillus licheniformis and Fecal streptococcus on water purification.Different strains and their combinations were cultured in sewage medium as trentment groups，sewage medium with no supplementation served as control. After 24 h，fermentations samples were taken from each group for analysis of degradation of ammonia-nitrogen and nitritenitrogen.Results showed that B.subtilis had greater capacity of ammonia-nitrogen degradation than other three strains，and removal rate reached 100%after 5 days.B.cereus，B.licheniformis，and F.streptococcus also had degradation capacity to a degree.Furthermore，nitrite degradation rate of B.subtilis was higher than other strains，with a rate of 85.60%at day 2，and 100%at day 3.B.licheniformis and F.streptococcus also had great nitrite degradation capacity，and nitrite concentration decreased to 0 at day 5.B.cereus could not degrade nitrite efficiently，with a degradation rate of 61.10%after 5 days. According to each strain’s capacity of water purification，the strains were combined at a certain ratio，and then cultured in sewage medium，the optimal combination was obtained with an ammonia-nitrogen removal rate of 81.33%at day 3，and 93.58%at day 6，nitrite concentratiuon also decreased to 0 at day 5.The results indicated that this combination had an efficient water purification property.

bacillus；ammonia nitrogen degradation；nitrite degradation；compound bacterium agent

S816.7

A

1004-3314（2016）13-0035-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161309