王廣慧

（黑龍江省綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化152061）

檢測分析

復合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的工藝優(yōu)化

王廣慧

（黑龍江省綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化152061）

為研究復合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的最適條件，本試驗通過單因素試驗和正交試驗，對固液比、酶反應(yīng)時間、酶反應(yīng)溫度、酶反應(yīng)pH、高壓時間及高壓溫度對黃酮得率的影響進行了研究，并以金針菇黃酮得率為評價指標，優(yōu)化提取工藝。試驗結(jié)果表明，復合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的最優(yōu)條件是：固液比為1∶35（g/mL），酶反應(yīng)時間為80 min，酶反應(yīng)溫度為50℃，酶反應(yīng)pH為6，高壓處理溫度為115℃，高壓處理時間為40 min。以上述條件從金針菇中提取黃酮，得率可達13.45%。

金針菇；黃酮；復合酶；高壓；提取

金針菇［Flammulinavelutiper（Fr.）Sing］中富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中的黃酮類化合物具有消除疲勞、保護心腦血管、預防動脈硬化、疏通微循環(huán)、抗衰老以及活化大腦和其他臟器細胞的功效，且毒副作用很?。ê畈ǖ龋?013；方玉梅等，2012a、b），既可作為保健食品，也可開發(fā)為動物飼料添加劑。目前關(guān)于金針菇黃酮提取工藝研究的報道很多，但普遍存在提取率低的缺點。本試驗采用復合酶輔助高壓法從金針菇中提取黃酮，其中的高壓提取技術(shù)是本課題組研發(fā)出來的有效提取食用菌中生物活性物質(zhì)的方法，目前已成功用于黑木耳多糖、香菇多糖及金針菇中總黃酮的提?。ㄍ鯊V慧等，2015、2013）。復合酶輔助高壓法集復合酶提取法和高壓提取法的優(yōu)點于一體，為開發(fā)金針菇黃酮提供了重要參考。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑金針菇由綏化學院微生物實驗室培養(yǎng)所得；木瓜蛋白酶和纖維素酶購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；試驗所用硝酸鋁、亞硝酸鈉等化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器TDL-5A型離心機：金壇市新航儀器廠；JK-G-500B2型高速粉碎機：上海精科儀器公司；752型分光光度計：上海光學儀器廠；BL-50A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋：上海衡平儀器儀表廠。

2　方法

2.1檢測方法線性回歸方程的獲?。阂蕴J丁標準品為對照，先加入5%的NaNO2溶液，再加入10%的Al（NO3）3溶液，最后加入4%的NaOH溶液（王廣慧等，2015）。在堿性條件下，黃酮類物質(zhì)可與鋁鹽相絡(luò)合。此絡(luò)合物在510 nm處表現(xiàn)出特征性的光吸收峰，其吸光值與黃酮的濃度呈正相關(guān)。

2.2復合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的具體操作方法將金針菇中的雜質(zhì)清除干凈，置于50℃烘箱中干燥至恒重，用高速粉碎機將其制成干粉并過80目篩。稱取每份為3.0 g的金針菇粉若干份，放于燒杯中，按試驗設(shè)計要求加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和復合酶（木瓜蛋白酶和纖維素酶按質(zhì)量比1∶1混合），在恒溫水浴鍋中進行酶解反應(yīng)，然后置于立式壓力蒸汽滅菌器中浸提。將提取液離心后所獲上清蒸發(fā)濃縮后用3倍體積的95%乙醇于4℃冰箱中沉淀過夜。沉淀中的多糖等雜質(zhì)可通過離心清除。按照2.1法測出提取液中黃酮含量并計算出黃酮得率。重復3次。

2.3試驗設(shè)計方案

2.3.1單因素試驗方案

2.3.1.1固液比影響的試驗設(shè)計分別在5份金針菇粉中加入樣品量1.00%的復合酶，并按照固液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）加入pH=5的緩沖液，在50℃下酶解80 min后再在108℃下高壓提取40 min。

2.3.1.2酶反應(yīng)時間影響的試驗設(shè)計在最佳固液比、酶添加量為1.00%、酶解溫度為50℃，反應(yīng)pH為5的條件下，設(shè)定酶反應(yīng)時間分別為50、60、70、80n、90 min，然后在108℃下高壓熱水浸提40 min，提取后測定黃酮得率。

2.3.1.3酶反應(yīng)溫度影響的試驗設(shè)計在最佳固液比、最佳酶反應(yīng)時間、酶添加量為1.00%、反應(yīng)pH為5的條件下，分別設(shè)置酶反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70℃，然后在108℃下高壓熱水浸提40 min，提取后測定黃酮得率。

2.3.1.4酶反應(yīng)pH影響的試驗設(shè)計在固液比、酶反應(yīng)時間及酶反應(yīng)溫度都取最佳值，酶添加量為1.00%的條件下，調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)pH，分別設(shè)為3、4、5、6、7，然后在108℃下高壓熱水浸提40 min，提取后測定黃酮得率。

2.3.1.5高壓溫度影響的試驗設(shè)計在上述四個影響因素都處于最佳值的情況下，將金針菇粉的高壓浸提溫度分別設(shè)為75、90、108、115、121℃，高壓處理時間設(shè)為40 min，提取后測定黃酮得率。

2.3.1.6高壓時間影響的試驗設(shè)計在以上影響因素都取最佳值的條件下，將金針菇粉分別按照高壓時間30、40、50、60、70 min進行處理并測定黃酮得率。

2.3.2正交試驗方案基于單因素試驗數(shù)據(jù)，選取對金針菇黃酮得率影響較大的因素和水平進行正交試驗設(shè)計，以優(yōu)化出提取金針菇黃酮的最適條件。

3　結(jié)果與分析

3.1線性回歸方程的獲取按照2.1所述方法進行試驗操作，得到線性回歸方程為：y=0.3759x+ 0.0196，R2=0.9979，式中：y為光吸收值，x為蘆?。S酮）含量，mg/mL。

3.2復合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的試驗結(jié)果

3.2.1單因素試驗結(jié)果

3.2.1.1固液比影響的試驗結(jié)果由圖1可知，黃酮得率在固液比為1∶35（g/mL）時達到最高點，為11.78%，可見太高或太低的固液比都不宜于黃酮的溶出，而且過高的固液比還會增加后續(xù)濃縮試驗的難度，所以選擇1∶35為金針菇黃酮提取的最佳固液比。

圖1　固液比對金針菇黃酮得率的影響

3.2.1.2酶反應(yīng)時間影響的試驗結(jié)果在最佳固液比為1∶35（g/mL）的條件下，改變酶反應(yīng)時間，得到的黃酮得率數(shù)據(jù)結(jié)果見圖2。

圖2　酶反應(yīng)時間對金針菇黃酮得率的影響

由圖2可知，80 min酶反應(yīng)時間時金針菇黃酮的得率最高，為11.78%，因此最佳酶反應(yīng)時間是80 min。分析其原因可能是酶反應(yīng)時間太短時酶解不徹底，而酶解時間過長又會使酶變性失活，所以兩種情況下都不利于金針菇細胞中黃酮物質(zhì)的溶出，導致黃酮得率降低。

3.2.1.3酶反應(yīng)溫度影響的試驗結(jié)果按照最佳料液比1∶35加緩沖液、酶解時間為80 min，在此條件下，改變酶反應(yīng)溫度，所得黃酮得率如圖3所示。

圖3　酶反應(yīng)溫度對金針菇黃酮得率的影響

由圖3可知，酶反應(yīng)溫度在50℃時金針菇黃酮的得率最高，為11.78%，因此最佳酶反應(yīng)溫度是50℃。分析原因可能是，溫度過低時酶活也低，而溫度過高又會導致酶變性失活。

3.2.1.4酶反應(yīng)pH影響的試驗結(jié)果在固液比、酶反應(yīng)時間及酶反應(yīng)溫度都取最佳值的條件下，調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)pH，所得黃酮得率如圖4所示。

圖4　酶反應(yīng)pH對金針菇黃酮得率的影響

由圖4可知，pH為6的反應(yīng)條件下可得到12.91%的黃酮得率，為最高，因此最佳酶反應(yīng)pH為6。分析原因可能是pH值過高或過低都會影響到酶和底物可解離基團的解離，從而影響到酶促反應(yīng)的速率。

3.2.1.5高壓溫度影響的試驗結(jié)果在上述四個影響因素都取最佳值的情況下，改變高壓熱水浸提溫度，所得黃酮得率如圖5所示。

圖5　高壓浸提溫度對金針菇黃酮得率的影響

由圖5可知，高壓處理溫度為115℃時黃酮得率最高，為13.45%。分析其原因可能是高壓浸提溫度過低時金針菇細胞沒有完全被解體，黃酮類物質(zhì)不能與溶媒充分接觸而不利于其釋放，而高壓浸提溫度過高則會破壞活性黃酮的分子結(jié)構(gòu)，從而降低其得率。

3.2.1.6高壓時間影響的試驗結(jié)果在以上影響因素都取最佳值的條件下，改變高壓浸提時間，得到的數(shù)據(jù)結(jié)果見圖6。

圖6　高壓浸提時間對金針菇黃酮得率的影響

由圖6可知，高壓浸提時間為40 min時黃酮的得率13.45%為最高，因此選擇40 min為最適的高壓處理時間。分析原因可能是高壓時間太短會導致金針菇細胞不能完全被破壞，從而使黃酮類物質(zhì)釋放不完全，而高壓時間太長則會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，降低活性黃酮的得率。

3.2.2正交試驗結(jié)果基于單因素試驗所得數(shù)據(jù)設(shè)計L9（34）正交試驗，設(shè)計方案見表1，其中固液比固定為1∶35（g/mL），酶添加量固定為1.00%，酶反應(yīng)時間固定為80 min。正交試驗結(jié)果見表2。

表1　L9（34）正交試驗因素與水平

表2　正交試驗結(jié)果

由表2可知，各因素對黃酮得率的影響大小順序依次為A（酶反應(yīng)溫度）＞C（高壓溫度）＞B（酶反應(yīng)pH）＞D（高壓時間），由此確定提取金針菇黃酮的最優(yōu)條件為A2C2B2D2，即：酶反應(yīng)溫度為50℃，高壓處理溫度為115℃，酶反應(yīng)pH為6，高壓處理時間為40 min。在此條件下做驗證試驗，得到金針菇總黃酮得率為13.45%。

4　結(jié)論

本試驗通過單因素試驗和正交試驗對復合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的工藝進行了優(yōu)化研究。研究結(jié)果顯示，此法對金針菇黃酮的提取效果較好，得率較高。分析其原因可能是：一方面，通過復合酶的酶解過程強化了傳質(zhì)過程，增加了黃酮的得率（王蕓蕓等，2008）；另一方面，高溫高壓作用能使細胞解體，使被提取物質(zhì)充分溶出（王廣慧等，2015）。由本試驗結(jié)果可知，復合酶輔助高壓法提取金針菇黃酮的最適條件是：固液比為1∶35（g/mL），酶反應(yīng)時間為80 min，酶反應(yīng)溫度為50℃，酶反應(yīng)pH為6，高壓處理溫度為115℃，高壓處理時間為40 min。以上述條件從金針菇中提取黃酮，得率可達13.45%。

［1］方玉梅，譚萍，王毅紅，等.金針菇黃酮類化合物清除DPPH自由基活性［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33（7）：8～10.

［2］方玉梅，張春生，譚萍，等.金針菇黃酮類化合物的抗氧化性作用［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：15～18.

［3］侯波，鄭淑彥，邰麗梅，等.金針菇營養(yǎng)保健功能及食品加工研究現(xiàn)狀［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（12）：122～126.

［4］王廣慧，戴明，魏雅冬.香菇多糖的提取工藝研究［J］.食品科技，2013，38（1）：192～194.

［5］王廣慧，魏雅冬，于德涵.高壓熱水浸提法提取金針菇黃酮的優(yōu)化研究［J］.食品科技，2015，40（3）：241～244.

［6］王蕓蕓，李莉，李香玉，等.復合酶法提取甘草渣中總黃酮［J］.化學與生物工程，2008，25（8）：49～51.

In this study，a composite enzyme assisted with high pressure extraction method was developed for the extraction of flavonoids from Flammulina velutiper.The extraction conditions were optimized through the single factor and orthogonal tests.The effects of solid-liquid ratio，enzymatic reaction time，enzymatic reaction temperature，enzymatic reaction pH，high-pressure extraction time and high-pressure extraction temperature on the extraction yield of flavonoids were investigated.The experimental results showed that the optimal condition was solid-liquid ratio of 1∶35（g/mL），enzymatic reaction time of 80 min，enzymatic reaction temperature of 50℃，enzymatic reaction pH of 6，high-pressure extraction temperature of 115℃and hig-pressure extraction time of 40 min.Under these conditions，the extraction yield of flavonoids from Flammulina velutipe was up to 13.45%.

Flammulina velutiper（Fr.）Sing；flavonoids；composite enzyme；high-pressure；extraction

水產(chǎn)養(yǎng)殖

S816.7

A

1004-3314（2016）13-0025-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161306

國家自然科學基金（21201128）；綏化學院科研創(chuàng)新團隊資助項目