陳浩雄 傅君舟 何 鳳 劉日光

2型糖尿病腎病患者腎組織中STOML2的表達及作用

陳浩雄 傅君舟 何 鳳 劉日光

廣州市第一人民醫(yī)院腎內科（廣州510180）

目的 探討2型糖尿病腎?。―N）患者腎組織中STOML2的表達及作用。方法 免疫組化檢測臨床2型糖尿病腎病患者腎組織STOML2的表達及定位，采用慢病毒轉染方法建立穩(wěn)定過表達STOML2的HK-2細胞系，并應用Western blot檢測腎小管上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）、Fibronectin和STOML2的表達。結果 STOML2在DN患者腎組織的腎小管上皮細胞胞漿中表達明顯升高。在高糖刺激HK-2細胞建立的EMT模型中，STOML2呈時間依賴表達上調。STOML2穩(wěn)定高表達時，E-cadherin表達下調，而Fibronectin明顯上調，即能促進腎小管上皮細胞發(fā)生EMT。結論 STOML2可能通過促進腎小管上皮細胞向間充質細胞分化，進而參與糖尿病腎病腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。

糖尿病腎病 上皮細胞-間質轉化 纖維化 STOML2

糖尿?。╠iabetic mellitus，DM）患者中，若血糖控制欠佳若干年可發(fā)展為糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）。DN是DM最常見也是最嚴重的并發(fā)癥之一，是導致終末期腎衰竭（End Stage Renal Disease，ESRD）的常見病因，這嚴重影響了DM患者的生存和預后，目前研究顯示，糖尿病腎病的發(fā)生率隨著DM患者年齡的增長和病程延長而不斷增高［1］。國內資料顯示，DN已成為我國ESRD的第二位病因［2］。迄今為止，糖尿病腎病的發(fā)病機制尚未完全闡明?，F有研究表明，腎小管間質纖維化是DN進展為ESRD的主要病理基礎，上皮細胞-間質轉化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）被認為是腎間質纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)之一［3］。Stomatin樣蛋白2（stomatin like protein 2，STOML2）是近期新發(fā)現的基因，該基因在惡性腫瘤中的表達上調明顯，可促進腫瘤的轉移［4］。在本項研究中，我們檢測臨床糖尿病腎病患者腎組織中STOML2的表達及定位，并探討其在腎小管上皮細胞向間質細胞轉化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco Invitrogen），小鼠抗STOML2單抗（美國Abcam），小鼠抗E-cadherin單抗和小鼠抗Fibronectin單抗（美國B&D），兔抗a-tubulin多抗（美國Santa Cruz）。質粒pSin-EF2-vector和pSin-EF2-STOML2由中山大學李雋教授惠贈。免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司。其余化學試劑為國產分析純化。

1.1.2 儀器設備 凝膠成像、圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad），Western印跡儀（美國R&D），紫外分光光度計（英國Jenway），3K18低溫離心機（美國Sigma），Zeiss Axio Imager A1正立熒光顯微鏡（德國ZEISS）。

1.2 方法

1.2.1 收集廣州市第一人民醫(yī)院腎內科經病理確診為2型糖尿病腎病且病理分期為III期的腎組織20例，并選取臨床腎癌患者正常腎組織（距腫瘤10 cm）10例作為對照。每例標本部分組織經4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋、切片。病理切片特殊染色（HE染色、Masson染色）由廣州市第一人民醫(yī)院病理科完成。

1.2.2 HKC細胞培養(yǎng)：人腎小管上皮細胞株（HK-2）由北京協(xié)和醫(yī)科大學鄭法雷教授惠贈。細胞用含10%FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3天傳代一次。將細胞消化吹打混勻，接種于6孔板中，待細胞生長至70%融合時，按實驗設計加入高糖（含50mmol/L葡萄糖）分別培養(yǎng)HK-2細胞24 h、48 h、72 h，收集細胞樣品，采用Western blot分析。

1.2.3 Western印跡 在各時間點收集細胞，加SDS細胞裂解液提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE電泳分離，電轉至硝酸纖維素膜，5%BSA封閉，STOML2（1∶1000）、E-cadherin（1∶2500）、fibronectin（1∶5000）一抗4℃孵育過夜，抗兔a-tubulin（1∶1000）一抗室溫孵育1 h，相應的二抗IgG（1∶1000）室溫孵育1 h后，顯影成像。以a-tubulin為內參，應用圖像分析軟件掃描特異性條帶。

1.2.4 免疫組織化學分析 采用免疫組化SP法檢測STOML2蛋白表達：取5μm厚的10%甲醛固定的石蠟切片，二甲苯脫蠟水化。3%過氧化氫（H2O2）5 min滅活內源性酶，PBS沖洗3次，熱修復抗原，室溫血清封閉10 min后分別滴加稀釋的一抗小鼠抗STOML2單克隆體（1：200），4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，滴加鼠二抗IgG，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，DAB顯色。蘇木素輕度復染核，自來水沖洗返藍，脫水、透明、封片，鏡檢。每次染色均同時以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。每張切片400倍下隨機選取20個不重疊視野，拍片。

1.2.5 構建STOML2穩(wěn)定過表達的HK-2細胞系 首先，采用磷酸鈣轉染制備慢病毒。將HEK293細胞均勻接種于10 cm皿中（培養(yǎng)皿預先以0.1%明膠鋪底），待細胞密度達到70%～80%時進行轉染。采用磷酸鈣法轉染，分別將目標質粒Psin-EF2-STOML2/Psin-EF2-vector 2μg及其包裝質粒psPAX2質粒2μg和pMD2.G質粒2μg，分別震蕩混勻加入67μl磷酸鈣轉染試劑，混勻室溫靜置20分鐘將轉染體系加入培養(yǎng)皿中，輕晃混勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h候后換液成完全培養(yǎng)基15mL，培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)基，2000 rpm離心，收集上清。超濾柱過濾，4℃，6000 g離心30 min，使體積縮小至1 mL。病毒濃縮液分裝后于-80℃冰箱存放，備用。其次，將慢病毒液感染靶細胞。將靶細胞HK-2細胞接種于6孔板，培養(yǎng)至60%左右密度，用生理鹽水洗一遍后加入2 mL完全培養(yǎng)基，再加入500μl病毒濃縮液，并加入polybrance試劑（促進病毒顆粒的融合感染）至終濃度為8μg/mL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。補加2 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)感染24 h。24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。并利用1μg/mL嘌呤霉素篩選已轉染成功的陽性克隆細胞，擴增后凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 結 果

2.1 STOML2在DN腎組織中表達明顯上調 正常對照組的HE染色顯示腎組織結構清晰，腎小球大小正常，腎間質無增寬；Masson染色顯示腎小球及腎間質無明顯膠原沉積；免疫組化顯示，近曲小管和遠曲小管的腎小管上皮細胞胞核中幾乎無STOML2表達。而DN腎組織HE染色顯示腎小球出現肥大或硬化，腎間質增寬；Masson染色顯示腎小球及腎間質有明顯膠原沉積，表明存在腎臟纖維化；免疫組化顯示，STOML2在腎小管上皮細胞漿高表達，明顯較對照組升高，見圖1。

2.2 STOML2在高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT模型中表達上調 高糖（High glucose，HG）（50 mmol/L）刺激HK-2細胞建立高糖誘導的EMT模型過程中，上皮細胞的Marker分子E-cadherin表達隨HG刺激時間的延長而降低，而間充質細胞的Marker分子Fibronectin隨HG刺激時間的延長而增加，此時STOML2表達逐漸上調，在HG刺激72h時表達最高，見圖2，提示STOML2可能參與調控高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT過程。

2.3 穩(wěn)定過表達STOML2可誘導HK-2細胞發(fā)生EMT 我們采用慢病毒的方法將質粒Psin-EF2-STOML2/Psin-EF2-vector分別轉染至HK-2細胞，采用嘌呤霉素篩選陽性克隆細胞，建立穩(wěn)定的細胞系（HK-2-Control，HK-2-STOML2），收集細胞樣品，采用Western blot檢測發(fā)現在STOML2穩(wěn)定高表達時，E-cadherin表達下調，而Fibronectin明顯上調，見圖3，表明STOML2可以誘導HK-2細胞發(fā)生EMT。

3 討 論

圖1 STOML2在DN腎組織中表達明顯上調（×200）

圖2 STOML2在高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT模型中表達上調

圖3 穩(wěn)定過表達STOML2可誘導HK-2細胞發(fā)生EMT

以往研究認為腎小球病變在糖尿病腎病的發(fā)病中起重要作用，然而近年來研究者發(fā)現腎小管間質病變在糖尿病腎臟病發(fā)病早期也至關重要，并且腎小管間質病變的嚴重程度與蛋白尿排泄量和腎功能進行性下降密切相關，對糖尿病腎病患者的生存和預后有嚴重影響［5］。糖尿病腎病患者的臨床病理變化為：早期出現腎小管肥大，空泡變性，腎小管管腔擴張，刷狀緣面積減少DN，腎小管基底膜增厚；晚期表現為腎小管萎縮及間質纖維化，間質纖維化的部位多伴有腎小球硬化。Gnudi等研究發(fā)現，糖尿病微量蛋白尿患者僅29%出現典型的腎小球硬化和小動脈透明變，然而有42%患者出現腎間質病變，表現為腎小管肥大和間質擴張［6］。糖尿病早期腎臟小管間質病理改變是啟動和促進腎小管間質纖維化進程的關鍵因素且不完全依賴于腎小球病變，是導致DN的獨立因素之一［7］，所以對DN腎小管間質病變的研究也非常重要。本研究發(fā)現STOML2在臨床DN患者腎組織及高糖誘導的腎小管上皮細胞中均高表達，體外高表達STOML2能明顯促進腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化，提示STOML2可能促進DN的纖維化發(fā)生發(fā)展。

DN進展為終末期腎病的主要病理基礎是腎小管間質纖維化，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在腎臟局部進行性積聚是DN的主要病理表現，而承擔ECM合成的主要是肌成纖維細胞［8］。目前研究表明在腎間質纖維化的發(fā)展過程中，約30%～50%的新增成纖維細胞來源于腎小管上皮細胞的EMT過程［9］。在糖尿病中引發(fā)EMT的原因主要為高血糖、血管緊張素Ⅱ（AT-Ⅱ）、晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）和氧化應激等這些因素均可促進TGF-β1的表達，并通過TGF-β通路的活化促進DN的發(fā)生發(fā)展［6，10］。EMT是具有極性的上皮細胞轉化成具有活動能力、能夠在細胞基質間自由移動的間質細胞的過程，其特征為上皮細胞表型喪失及間質特性的獲得。EMT主要表現為上皮細胞標志蛋白上皮鈣粘蛋白（E-cadherin）、ZO-1、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等的表達降低；間質細胞標志蛋白纖維連結素（Fibronectin）、玻形蛋白（vimentin）、神經鈣粘蛋白（N-catenin）等表達增加，導致細胞形態(tài)和結構改變［11］。Zhang等［12］的研究發(fā)現STOML2能降低食管鱗狀上皮細胞的粘附，下調E-cadherin表達。本研究顯示穩(wěn)定過表達STOML2的腎小管上皮細胞，上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達明顯下調，而間充質細胞標志蛋白Fibronectin明顯上調，表明STOML2能有效促進腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化，進而促進細胞外基質的生成。

由于腎纖維化早期階段的EMT是可逆的，所以及早干預有可能誘導已發(fā)生EMT的腎小管上皮細胞恢復正常，維持腎臟正常的組織結構和功能。通過本項研究，明確了高糖能上調STOML2的表達，且高表達STOML2能有效促進腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，這不僅加深了對EMT及DN腎間質纖維化的認識，還提示減低STOML2的表達和功能可作為一個新的DN治療靶點。

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The role of STOML2 in renal tissue of patients w ith type 2 diabetic nephropathy

Chen Haoxiong，Fu Junzhou，He Feng，et al.Department of Nephrology，Guangzhou First People'sHospital，Guangzhou 510180，China

Objective To investigate the expression and role of STOML2 in renal tissue of patientswith type 2 diabetic nephropathy. M ethods To detecthe expression and localization of STOML2 in clinical renal tissue in patientswith type 2 diabetic nephropathy by immunohistochemistry，and use lentiviral transfectionmethod to establish a stable cell line of over-expressing STOML2，lastly applywestern blot to detect the expression of E-cadherin，Fibronectin and STOML2 in renal tubular epithelial cells. Results STOML2 was significantly increased in renal tubular epithelial cytoplasm of patients with DN.In the EMT model of HK-2 cells stimulated by high glucose，STOML2 was increased in a time dependent.Overexpression of STOML2 led to E-cadherin down-regulated，while Fibronectin up-regulated，which promoted the occurrence of EMT in renal tubular epithelial cells. Conclusion STOML2 may be involved in the development and progression of renal fibrosis in diabetic nephropathy by mediating epithelial-mesenchymal transition of renal tubular epithelial cells.

Diabetic nephropathy；Epithelial-mesenchymal transition；Fibrosis；STOML2

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.013

2016-04-08）

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技引導項目（20151A010019）

傅君舟，E-mail：fujzhou@163.com