胡錦興 彭德虎 梁小朋 何司琪 韓建芳 吳碧彤 羅立全 馮永忠 林兆原

·論著·

MAV3104與鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群耐克拉霉素作用研究

胡錦興 彭德虎 梁小朋 何司琪 韓建芳 吳碧彤 羅立全 馮永忠 林兆原

廣州市胸科醫(yī)院肺外結(jié)核八內(nèi)科（廣州510095）

目的 研究鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群（MAC）MAV3104基因編碼蛋白與藥物外排的關(guān)系。方法 以MAC標(biāo)準(zhǔn)株基因組為模板，擴(kuò)增MAV3104基因，構(gòu)建pMV261-MAV3104c重組質(zhì)粒；測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到大腸桿菌DH5并在MAC標(biāo)準(zhǔn)株中誘導(dǎo)表達(dá)，Western Blot鑒定MAV3104表達(dá)；按照CLSIM24-A2的操作要求檢測(cè)MAC標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)克拉霉素的敏感性及外排泵抑制試驗(yàn)。結(jié)果 經(jīng)基因測(cè)序及Western Blot蛋白表達(dá)驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；MAV3104過表達(dá)能提高鳥分枝桿菌對(duì)克拉霉素的MIC，且硫利達(dá)嗪能抑制該作用；MAV3104過表達(dá)也能提高胞內(nèi)分枝桿菌對(duì)克拉霉素的MIC，但硫利達(dá)嗪對(duì)其沒有抑制效應(yīng)。結(jié)論 MAV3104轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物外排在鳥分枝桿菌耐克拉霉素中起重要作用。

鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群 MAV3104 耐藥 克拉霉素

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculousmycobacte-ria，NTM）是分枝桿菌屬內(nèi)除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌的統(tǒng)稱［1］。通常認(rèn)為非結(jié)核分枝桿菌為條件致病菌，其中某些菌可以引起肺部、淋巴結(jié)、皮膚組織等感染［2］。近些年來，流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明全世界范圍內(nèi)由非結(jié)核分枝桿菌引起的肺病呈上升趨勢(shì)。全國(guó)流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示：NTM在分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中的比例由1990年的4.9%增加到2000年的11.1%［3］，2010年增至22.9%［4］，以每10年約1倍的速度增長(zhǎng)。因此，非結(jié)核分枝桿菌同樣是我國(guó)面臨的一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題。

在所有非結(jié)核分枝桿菌種類中，鳥分枝桿菌復(fù)合群是最為常見的致病菌［5］。它主要包括鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌兩種［6］，它們?cè)谥虏⌒院推渌飳W(xué)特性方面表現(xiàn)出較大的差別［7］。

鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群（MAC）感染的治療非常棘手，克拉霉素被常規(guī)用于MAC感染的治療［8］，但克拉霉素耐藥的MAC臨床株迅速增加，其具體的耐藥機(jī)制并不清楚。有研究顯示MAV3104在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTC）中的相似蛋白——Rv1667c，已被證實(shí)在MTC耐受克拉霉素中發(fā)揮重要作用［9］，故我們推測(cè)，MAC中的MAV3104很大可能也是一種克拉霉素特異的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其表達(dá)及功能改變導(dǎo)致耐藥發(fā)生。本研究探討MAV3104在MAC克拉霉素耐藥中可能的作用及其機(jī)制，以期為NTM耐藥機(jī)制研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 MAC標(biāo)準(zhǔn)株均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心，分別是：鳥分枝桿菌ATCC25291，胞內(nèi)分枝桿菌ATCC13950。E.coli DH5購(gòu)自Takara公司，pMV261Vector大腸桿菌與MAC的穿梭質(zhì)粒載體，4488 bp，含卡那霉素抗性，為廣州市胸科醫(yī)院保存。

1.1.2 試劑與儀器 DNA提取液購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。Takara TaqTM普通PCR試劑、DNA Marker購(gòu)自日本Takara公司。1.5 mL微離心管、PCR反應(yīng)管購(gòu)自美國(guó)Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 參照GeneBank中各基因的標(biāo)準(zhǔn)序列，應(yīng)用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)各自的擴(kuò)增引物和測(cè)序引物；設(shè)計(jì)好的引物交由專門的公司進(jìn)行合成。

1.2.2. 普通PCR 50μl的PCR反應(yīng)總體系包括5μl 10 ×PCR Taq Buffer、4μl 2.5 mM dNTP溶液、50μM引物各0.5μl、1.25 U Taq DNA聚合酶和2μl的DNA模板。反應(yīng)體系在普通PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸2 min共30個(gè)循環(huán)，72℃補(bǔ)齊3 min。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR ①采用商品化試劑盒提取MAC的RNA，嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行操作，經(jīng)過破壁、裂解、沉淀、純化、干燥和溶解等步驟后將提取的總RNA置-80℃保存?zhèn)溆?。?0μl的逆轉(zhuǎn)錄體系包括4μl緩沖液、0.5μl RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶溶液1μl、總RNA溶液10μl和4.5μl DEPC水。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為30℃10 min，42℃60 min，95℃5 min。③實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)體系為20 μl，包括10μl的MightyAmp Mix、0.4μl的ROX參比熒光染料、50μM的引物各0.2μl、8.2μl的ddH2O和1μl的cDNA模板。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，應(yīng)用儀器配套的分析軟件進(jìn)行擴(kuò)增分析。反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s、65℃退火延伸15 s共30個(gè)循環(huán)，68℃補(bǔ)齊30 s。熔解曲線分析程序?yàn)椋?5℃變性15 s，60℃復(fù)性1 min，以0.05℃/s的速度升溫至95℃并維持15 s，最后60℃復(fù)性15 s。

1.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)化 PCR擴(kuò)增目的片段后，選用核酸內(nèi)切酶AccⅢ和Bsp1061對(duì)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，接著將酶切后的PCR產(chǎn)物與穿梭質(zhì)粒pMV261進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，涂板培養(yǎng)后挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定，最后把陽(yáng)性克隆測(cè)序以確定目的片段是否已被正確克隆。采用醋酸鋰方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)MAC臨床敏感株中，取新鮮培養(yǎng)的MAC洗滌兩次后，用醋酸鋰懸浮兩次后分裝于微量離心管中，依次加入其它轉(zhuǎn)化用試劑和DNA后，劇烈振蕩并水浴離心重懸即可。

1.2.5 DNA序列測(cè)定 采用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，并將片段大小符合且亮度很高的PCR產(chǎn)物送核酸測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果采用Chromas2軟件進(jìn)行處理，DNA序列采用DNAMAN軟件進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將MAC標(biāo)準(zhǔn)株分別培養(yǎng)一周后，取培養(yǎng)液離心，離心后取沉淀用于MAV3104表達(dá)水平檢測(cè)，確定MAV3104過表達(dá)是否成功。提取沉淀中的總蛋白并進(jìn)行初步濃度測(cè)定，將濃度做適當(dāng)稀釋后用于Western Blot試驗(yàn)，進(jìn)行半定量分析。

1.2.7 檢測(cè)MAC標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)克拉霉素的敏感性 將鑒定為MAC的臨床菌株轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，待長(zhǎng)出肉眼可見的菌落后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，嚴(yán)格按照CLSIM24-A2的要求進(jìn)行操作。

1.2.8 泵抑制試驗(yàn) 克拉霉素預(yù)處理MAC一周后，加入泵抑制劑硫利達(dá)嗪，培養(yǎng)2h后取一半培養(yǎng)液進(jìn)行克拉霉素敏感性檢測(cè)。取另一半培養(yǎng)液進(jìn)行離心，應(yīng)用液相色譜儀檢測(cè)上清液中克拉霉素濃度；將沉淀洗滌后提取總RNA并進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)MAV3104編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，連續(xù)變量ˉx±s表示，組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果及MAV3104重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：MAV3104基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳后得到約1775 bp的特異性條帶，大小與預(yù)測(cè)一致，見圖1。以載體pMV261-MAV3104為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小約1775 bp，核酸內(nèi)切酶AccⅢ和Bsp1061雙酶切鑒定結(jié)果見圖2。選取MAV3104陽(yáng)性質(zhì)粒至上海生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果均與NCBIBlast結(jié)果完全吻合，證實(shí)重組質(zhì)粒pMV261-MAV3104構(gòu)建成功。

圖1 MAV3104擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 轉(zhuǎn)染后MAV3104在鳥分枝桿菌中的基因表達(dá)情況：轉(zhuǎn)染了pMV261-MAV3104質(zhì)粒的鳥分枝桿菌中的MAV3104 mRNA表達(dá)水平高于空白對(duì)照及空載體對(duì)照組（8.46± 0.15 vs 0.99±0.05，8.46±0.15 vs 1.36±0.05）（P＜0.05），空白對(duì)照及空載體對(duì)照組之間無差異，見圖3；轉(zhuǎn)染了pMV261-MAV3104質(zhì)粒的胞內(nèi)分枝桿菌中的MAV3104 mRNA具有同樣的結(jié)果，（7.56±0.24 vs 0.95± 0.13，7.56±0.24 vs 1.42±0.08）（P＜0.05），見圖4。

2.3 鳥胞內(nèi)分枝桿菌MAV3104蛋白的Western blot鑒定結(jié)果：轉(zhuǎn)染了pMV261-MAV3104質(zhì)粒的鳥分枝桿菌中的MAV3104蛋白表達(dá)水平高于空白對(duì)照及空載體對(duì)照組（0.264±0.05 vs 0.06±0.02，0.264±0.05 vs 0.06±0.01）（P＜0.05），空白對(duì)照及空載體對(duì)照組之間無明顯差異；轉(zhuǎn)染了pMV261-MAV3104質(zhì)粒的胞內(nèi)分枝桿菌中的MAV3104蛋白表達(dá)具有同樣的結(jié)果，（0.168±0.04 vs0.05 ±0.01，0.168±0.04 vs0.04±0.03）（P＜0.05），見圖5。

圖4 三組胞內(nèi)分枝桿菌MAV3104 mRNA表達(dá)水平

圖5 三組鳥胞內(nèi)分枝桿菌MAV3104蛋白的表達(dá)水平

2.4 重組鳥分枝桿菌及外排泵抑制劑（硫利達(dá)嗪）對(duì)克拉霉素MIC影響：重組pMV261-MAV3104鳥分枝桿菌對(duì)克拉霉素的MIC高于空載體對(duì)照組，而外排泵抑制劑（硫利達(dá)嗪）可以部分抑制該情況下MIC的升高（85.2±3.96 vs 24.2±2.77，85.2±3.96 vs 39.8±3.03）（P＜0.05），見圖6。

2.5 重組胞內(nèi)分枝桿菌及外排泵抑制劑（硫利達(dá)嗪）對(duì)克拉霉素MIC影響：重組pMV261-MAV3104胞內(nèi)分枝桿菌對(duì)克拉霉素的MIC高于空載體對(duì)照組，而外排泵抑制劑（硫利達(dá)嗪）不能抑制該情況下MIC的升高（67.2±3.12 vs 32.2±2.13，P＜0.05；67.2±3.12 vs 60.8±3.03，P＜0.05），見圖7。

圖6 重組鳥分枝桿菌菌株對(duì)克拉霉素的MIC測(cè)定

圖7 重組胞內(nèi)分枝桿菌菌株對(duì)克拉霉素的MIC測(cè)定

3 討 論

由于免疫受損及免疫低下人群的擴(kuò)大，全球NTM感染日益增多［9］。其中，MAC是最常見的條件致病性NTM之一，可引起肺部感染和血液感染等癥狀［10］。MAC包括鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌，二者在基因組構(gòu)成非常接近，故常被歸于MAC進(jìn)行研究，但是它們?cè)谥虏⌒院推渌飳W(xué)特性方面表現(xiàn)出較大的差別［7］。有研究表明，鳥分枝桿菌容易感染艾滋病患者，而胞內(nèi)分枝桿菌更易于使非HIV感染患者致病。此外，與鳥分枝桿菌引起的肺病相比，胞內(nèi)分枝桿菌引起的肺病癥狀更嚴(yán)重而且預(yù)后更不理想［11］。

以往文獻(xiàn)報(bào)道鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群的耐藥主要是由于靶基因突變導(dǎo)致MAC對(duì)克拉霉素耐藥［12-13］。本研究中，過表達(dá)MAV3104，可以使到鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群對(duì)克拉霉素的MIC值下降2～3倍以上，故推測(cè)MAV3104是MAC胞膜上一種可特異轉(zhuǎn)運(yùn)克拉霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其過度表達(dá)可導(dǎo)致克拉霉素外排增多，從而降低MTC胞內(nèi)該藥物的蓄積濃度，最終通過減少藥物對(duì)MAC的作用使細(xì)菌得以存活。此外，本研究結(jié)果顯示鳥分枝桿菌外排泵抑制劑硫利達(dá)嗪對(duì)克拉霉素耐藥的抑制率高于對(duì)胞內(nèi)分枝桿菌克拉霉素耐藥的抑制率，顯示鳥分枝桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥性主要是以外排泵機(jī)制為主。

近年來，由于MAC感染患者的劇增和抗生素的不合理使用，克拉霉素耐藥的MAC臨床株迅速增加［14］。由于能用于MAC感染治療的藥物非常有限，一旦克拉霉素發(fā)生耐藥，很大程度上也意味著阿奇霉素耐藥，這樣就幾乎沒有合適的藥物可供選擇了。所以，我們必須密切關(guān)注MAC克拉霉素耐藥并研究其內(nèi)在分子機(jī)制，對(duì)臨床合理應(yīng)用抗菌物，減少耐藥菌的出現(xiàn)及新藥的開發(fā)具有重要意義。

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Association of M ycobacterium avium-M ycobacterium intracellulare comp lex in MAV3104 in drug resistance of Clarithromycin

Hu Jinxing，Peng Dehu，Liang Xiaopeng，et al.The Department of Extra-pulmonary Tuberculosis，Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095，China

Objective To investigate the association of the protein coded by Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex in MAV3104 in drug efflux of Clarithromycin. M ethods According to the Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex standard strain，the MAV3104 gene was amplified by PCR and cloned into expression vector pMV261 to generate the recombinant plasmids.After verification by sequence analysis，the recombinant plasmidswas transformed into E.coliDH5 and Mycoba ctenum avium-Mycobacterium intracellulare complex standard strain.To identify the protein expression bywestern blotting and investigate the sensitivity of clarithromycin and efflux pump inhibition test in the lightof CLSIM24-A2 protocol. Results It was verified by sequence analysis and western blotting that the recombinant plasmids were successfully constructed.Over expression ofMycobacterium avium MAV3104 gene could enhance clarithromycin MIC，which could be inhibited by thioridazine.Over expression of Mycobacterium intracellulare MAV3104 gene also could enhance clarithromycin MIC，but it could not inhibited by thioridazine. Conclusion This study demonstrates that efflux pumpsmediated by MAV3104 protein play an important role in Mycobacterium avium resistance to clarithromycin.

Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex；MAV3104；Drug resistance；Clarithromycin

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.001

2016-05-04）

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（20151A011037）