●李林

結(jié)直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達(dá)相關(guān)性研究

●李林

目的：探討結(jié)直腸癌k-ras基因突變與ERCC1mRNA表達(dá)相關(guān)性，為結(jié)直腸癌化療提供理論依據(jù)。方法 選擇2012年1月～2014年6月間我院送檢的結(jié)直腸癌病例92例，應(yīng)用直接測(cè)序法檢測(cè)腫瘤組織k-ras基因突變情況，應(yīng)用RT-PCR相對(duì)定量分檢測(cè)腫瘤組織ERCC1mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：92例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中，共有29例發(fā)生了k-ras突變，突變發(fā)生率為31.5%。k-ras突變型患者ERCC1mRNA表達(dá)水平顯著高于k-ras野生型患者（P＜0.05）。不同腫瘤長(zhǎng)度、浸潤(rùn)深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ERCC1mRNA表達(dá)水平（△CT）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Pearson相關(guān)分析顯示ERCC1mRNA表達(dá)水平與腫瘤長(zhǎng)度、浸潤(rùn)深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P＞0.05），與k-ras突變發(fā)生呈正相關(guān)（r=0.667, P＜0.05）。結(jié)論：結(jié)直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達(dá)密切相關(guān)，二者可能與結(jié)直腸癌化療聯(lián)合西妥昔單抗治療耐藥有一定關(guān)系。

結(jié)直腸癌；k-ras基因；ERCC1；突變

結(jié)直腸癌是消化道最為常見的惡性腫瘤腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前，化療仍是結(jié)直腸癌治療的重要手段之一。近年來，分子靶向治療藥物西妥昔單抗的應(yīng)用大大提高了結(jié)直腸癌的化療效果，但有部分患者對(duì)西妥昔單抗耐藥，給治療帶來了困難[1]。k-ras基因是腫瘤細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）通路上的關(guān)鍵因子，該基因突變可以導(dǎo)致EGFR通路異常激活，干擾治療效果[2]。而切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因（ERCC1）是DNA損傷修復(fù)中的關(guān)鍵基因[3]。多項(xiàng)研究表明[4,5]，ERCC1表達(dá)水平與化療藥物耐藥有密切關(guān)系。本研究對(duì)我院92例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織k-ras基因突變狀態(tài)和ERCC1基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，旨在為結(jié)直腸化療敏感性預(yù)測(cè)提供參考：

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2012年1月～2014年6月間我院病理科送檢基因檢測(cè)的結(jié)直腸癌病例92例的腫瘤組織石蠟標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師確診。其中男性59例，女性33例；年齡38～83歲，平均年齡（58.7±12.4）歲；低分化16例，中分化48例，高分化28例；浸潤(rùn)至肌層24例，浸潤(rùn)至纖維膜層68例；腫瘤長(zhǎng)度：≤3cm 21例，＜3cm且≤6cm 58例，＞6cm13例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性42例，陽(yáng)性50例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn)：II期45例，III期47例。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤組織k-ras基因突變分析

切取10um厚石蠟包埋切片5張，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后取腫瘤組織，應(yīng)用DNA提取試劑盒（美國(guó)OMEGA公司生產(chǎn)）提取DNA，應(yīng)用直接測(cè)序法檢測(cè)k-ras基因第2外顯子第12、13密碼子基因序列，根據(jù)NCBI提供k-ras基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，反應(yīng)體系：PCR Buffer 2uL，Taq DNA polymerase 0.2uL，Mg2+ Solution 0.75uL，Dntp 2uL，Primer 1uL，模板DNA 1uL，去離子水12uL，95°C變性15min，94°C變性50s，57°C退火1min，72°C延伸1min，循環(huán)35次，72°C延伸10min。上樣至ABI3100-Avant遺傳分析儀進(jìn)行測(cè)序，Data collection 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，Sequencing analysis 5.1軟件進(jìn)行序列分析。

1.2.2 ERCC1 mRNA測(cè)定

應(yīng)用RT-Q PCR試劑盒（美國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)），按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。RT-Q PCR反應(yīng)體系：Master Mix 2.5uL，模板cDNA1uL，ERCC1上、下游引物各0.25uL，去離子水1uL。反應(yīng)條件：95°C變性10min，60°C變性1min，上熒光PCR擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)，溶解曲線溫度設(shè)定為95°C 15s，60°C 15s，95°C 15s。實(shí)時(shí)定量分析PCR數(shù)據(jù)，設(shè)定基線，以管家基因β-actin設(shè)為內(nèi)參，將循環(huán)數(shù)CT值相對(duì)于β-actin的相對(duì)表達(dá)量作為ERCC1 mRNA表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以中位數(shù) (最小值，最大值)形式表示，組間顯著性檢驗(yàn)采用Wilcoxon test秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)分析， P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者k-ras突變情況

92例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中，共有29例發(fā)生了k-ras突變，占31.5%，其中G12D12例，G13D7例，G12V4例，G12C3例，G13C1例，G12S2例。

2.2 k-ras突變患者ERCC1mRNA表達(dá)情況

92例患者腫瘤組織ERCC1mRNA表達(dá)（△CT）為4.532（0.183,9.872），k-ras突變型患者ERCC1mRNA表達(dá)水平顯著高于k-ras野生型患者（P＜0.05）。

表1 k-ras突變型患者與k-ras野生型患者ERCC1mRNA表達(dá)情況比較(x±s)

2.3 不同臨床病理特征患者ERCC1mRNA表達(dá)情況

不同腫瘤長(zhǎng)度、浸潤(rùn)深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ERCC1mRNA表達(dá)水平（△CT）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

臨床病理特征 n ERCC1mRNA表達(dá)（△CT） U P

2.4 ERCC1mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示ERCC1mRNA表達(dá)水平與腫瘤長(zhǎng)度、浸潤(rùn)深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P＞0.05），與k-ras突變發(fā)生呈正相關(guān)（r=0.667, P＜0.05）。

3 討論

近年來，分子靶向治療藥物西妥昔單抗聯(lián)合化療的應(yīng)用使結(jié)直腸癌的臨床療效大大提高。但仍有部分患者對(duì)西妥昔單抗和化療藥物產(chǎn)生原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥，因此篩選獲益人群并合理應(yīng)用分子靶向治療對(duì)于結(jié)直腸癌尤為重要。國(guó)外有研究報(bào)道[6]，對(duì)于k-ras野生型結(jié)直腸癌患者應(yīng)用西妥昔單抗聯(lián)合奧沙利鉑為基礎(chǔ)的一線化療方案療效顯著提高，而該

方案k-ras突變型結(jié)直腸癌患者療效不佳。k-ras基因是一原癌基因，位于人類第12染色體上，其所編碼的k-ras蛋白是細(xì)胞膜酪氨酸激酶相關(guān)受體（如EGFR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的“開關(guān)”分子，在細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)和凋亡中起到重要的作用[7,8]。當(dāng)k-ras基因發(fā)生突變時(shí)可以導(dǎo)致k-ras蛋白持續(xù)激活，并加快細(xì)胞惡變。目前，關(guān)于結(jié)直腸癌k-ras基因突變發(fā)生率的報(bào)道不盡相同，一般為40%～50%，西方國(guó)家發(fā)生率高于東方[9]。本研究中92例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中，共有29例發(fā)生了k-ras突變，占31.5%，其中G12D12例，G13D7例，G12V4例，G12C3例，G13C1例，G12S2例，符合相關(guān)報(bào)道[10]。

鉑類藥物是臨床上治療結(jié)直腸癌最常用的化療藥物，但該藥易產(chǎn)生耐藥性[11]。有研究報(bào)道，ERCC1mRNA表達(dá)水平與患者對(duì)鉑類藥物的敏感性呈負(fù)相關(guān)，其表達(dá)水平越高患者對(duì)鉑類藥物的敏感性越低[12]。ERCC1在核苷酸修復(fù)系統(tǒng)中起到限速和調(diào)節(jié)作用，當(dāng)ERCC1mRNA高表達(dá)時(shí)，可以使停滯在G2/M期的損傷DNA迅速修復(fù)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物耐藥，影響治療效果[13]。本研究結(jié)果顯示，不同腫瘤長(zhǎng)度、浸潤(rùn)深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ERCC1mRNA表達(dá)水平（△CT）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，k-ras突變型患者ERCC1mRNA表達(dá)水平顯著高于k-ras野生型患者，Pearson相關(guān)分析顯示ERCC1mRNA表達(dá)水平與腫瘤長(zhǎng)度、浸潤(rùn)深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性，與k-ras突變發(fā)生呈正相關(guān)。提示ERCC1與k-ras基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌耐藥機(jī)制中可能起到協(xié)同作用。這對(duì)結(jié)直腸癌分子靶向治療對(duì)象篩選有一定意義。由于西妥昔單抗主要通過與EGFR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合起到抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的作用，而k-ras蛋白是EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的“開關(guān)”分子，該基因突變可以導(dǎo)致EGFR通路異常激活，干擾治療效果[14]。通過檢測(cè)腫瘤組織中k-ras突變情況和ERCC1mRNA表達(dá)，有助于了解患者對(duì)分子靶向治療的敏感性，為聯(lián)合西妥昔單抗化療提供增效依據(jù)。

綜上所述，結(jié)直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達(dá)密切相關(guān)，二者可能與結(jié)直腸癌化療聯(lián)合西妥昔單抗治療耐藥有一定關(guān)系。

（作者單位：貴航集團(tuán)三0二醫(yī)院）

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