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        結(jié)直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達(dá)相關(guān)性研究

        2016-11-03 05:01:59李林
        保健文匯 2016年12期
        關(guān)鍵詞:西妥基因突變單抗

        ●李林

        結(jié)直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達(dá)相關(guān)性研究

        ●李林

        目的:探討結(jié)直腸癌k-ras基因突變與ERCC1mRNA表達(dá)相關(guān)性,為結(jié)直腸癌化療提供理論依據(jù)。方法 選擇2012年1月~2014年6月間我院送檢的結(jié)直腸癌病例92例,應(yīng)用直接測序法檢測腫瘤組織k-ras基因突變情況,應(yīng)用RT-PCR相對定量分檢測腫瘤組織ERCC1mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:92例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中,共有29例發(fā)生了k-ras突變,突變發(fā)生率為31.5%。k-ras突變型患者ERCC1mRNA表達(dá)水平顯著高于k-ras野生型患者(P<0.05)。不同腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ERCC1mRNA表達(dá)水平(△CT)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示ERCC1mRNA表達(dá)水平與腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05),與k-ras突變發(fā)生呈正相關(guān)(r=0.667, P<0.05)。結(jié)論:結(jié)直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達(dá)密切相關(guān),二者可能與結(jié)直腸癌化療聯(lián)合西妥昔單抗治療耐藥有一定關(guān)系。

        結(jié)直腸癌;k-ras基因;ERCC1;突變

        結(jié)直腸癌是消化道最為常見的惡性腫瘤腫瘤之一,近年來發(fā)病率呈上升趨勢。目前,化療仍是結(jié)直腸癌治療的重要手段之一。近年來,分子靶向治療藥物西妥昔單抗的應(yīng)用大大提高了結(jié)直腸癌的化療效果,但有部分患者對西妥昔單抗耐藥,給治療帶來了困難[1]。k-ras基因是腫瘤細(xì)胞表皮生長因子受體(EGFR)通路上的關(guān)鍵因子,該基因突變可以導(dǎo)致EGFR通路異常激活,干擾治療效果[2]。而切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(ERCC1)是DNA損傷修復(fù)中的關(guān)鍵基因[3]。多項(xiàng)研究表明[4,5],ERCC1表達(dá)水平與化療藥物耐藥有密切關(guān)系。本研究對我院92例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織k-ras基因突變狀態(tài)和ERCC1基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測,旨在為結(jié)直腸化療敏感性預(yù)測提供參考:

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料

        2012年1月~2014年6月間我院病理科送檢基因檢測的結(jié)直腸癌病例92例的腫瘤組織石蠟標(biāo)本,所有標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師確診。其中男性59例,女性33例;年齡38~83歲,平均年齡(58.7±12.4)歲;低分化16例,中分化48例,高分化28例;浸潤至肌層24例,浸潤至纖維膜層68例;腫瘤長度:≤3cm 21例,<3cm且≤6cm 58例,>6cm13例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性42例,陽性50例;根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn):II期45例,III期47例。

        1.2 方法

        1.2.1 腫瘤組織k-ras基因突變分析

        切取10um厚石蠟包埋切片5張,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化后取腫瘤組織,應(yīng)用DNA提取試劑盒(美國OMEGA公司生產(chǎn))提取DNA,應(yīng)用直接測序法檢測k-ras基因第2外顯子第12、13密碼子基因序列,根據(jù)NCBI提供k-ras基因序列設(shè)計PCR引物,反應(yīng)體系:PCR Buffer 2uL,Taq DNA polymerase 0.2uL,Mg2+ Solution 0.75uL,Dntp 2uL,Primer 1uL,模板DNA 1uL,去離子水12uL,95°C變性15min,94°C變性50s,57°C退火1min,72°C延伸1min,循環(huán)35次,72°C延伸10min。上樣至ABI3100-Avant遺傳分析儀進(jìn)行測序,Data collection 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,Sequencing analysis 5.1軟件進(jìn)行序列分析。

        1.2.2 ERCC1 mRNA測定

        應(yīng)用RT-Q PCR試劑盒(美國QIAGEN公司生產(chǎn)),按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。RT-Q PCR反應(yīng)體系:Master Mix 2.5uL,模板cDNA1uL,ERCC1上、下游引物各0.25uL,去離子水1uL。反應(yīng)條件:95°C變性10min,60°C變性1min,上熒光PCR擴(kuò)增50個循環(huán),溶解曲線溫度設(shè)定為95°C 15s,60°C 15s,95°C 15s。實(shí)時定量分析PCR數(shù)據(jù),設(shè)定基線,以管家基因β-actin設(shè)為內(nèi)參,將循環(huán)數(shù)CT值相對于β-actin的相對表達(dá)量作為ERCC1 mRNA表達(dá)量。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

        應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以中位數(shù) (最小值,最大值)形式表示,組間顯著性檢驗(yàn)采用Wilcoxon test秩和檢驗(yàn),相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)分析, P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 結(jié)直腸癌患者k-ras突變情況

        92例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中,共有29例發(fā)生了k-ras突變,占31.5%,其中G12D12例,G13D7例,G12V4例,G12C3例,G13C1例,G12S2例。

        2.2 k-ras突變患者ERCC1mRNA表達(dá)情況

        92例患者腫瘤組織ERCC1mRNA表達(dá)(△CT)為4.532(0.183,9.872),k-ras突變型患者ERCC1mRNA表達(dá)水平顯著高于k-ras野生型患者(P<0.05)。

        表1 k-ras突變型患者與k-ras野生型患者ERCC1mRNA表達(dá)情況比較(x±s)

        2.3 不同臨床病理特征患者ERCC1mRNA表達(dá)情況

        不同腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ERCC1mRNA表達(dá)水平(△CT)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

        臨床病理特征 n ERCC1mRNA表達(dá)(△CT) U P

        2.4 ERCC1mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

        Pearson相關(guān)分析顯示ERCC1mRNA表達(dá)水平與腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05),與k-ras突變發(fā)生呈正相關(guān)(r=0.667, P<0.05)。

        3 討論

        近年來,分子靶向治療藥物西妥昔單抗聯(lián)合化療的應(yīng)用使結(jié)直腸癌的臨床療效大大提高。但仍有部分患者對西妥昔單抗和化療藥物產(chǎn)生原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥,因此篩選獲益人群并合理應(yīng)用分子靶向治療對于結(jié)直腸癌尤為重要。國外有研究報道[6],對于k-ras野生型結(jié)直腸癌患者應(yīng)用西妥昔單抗聯(lián)合奧沙利鉑為基礎(chǔ)的一線化療方案療效顯著提高,而該

        方案k-ras突變型結(jié)直腸癌患者療效不佳。k-ras基因是一原癌基因,位于人類第12染色體上,其所編碼的k-ras蛋白是細(xì)胞膜酪氨酸激酶相關(guān)受體(如EGFR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的“開關(guān)”分子,在細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動和凋亡中起到重要的作用[7,8]。當(dāng)k-ras基因發(fā)生突變時可以導(dǎo)致k-ras蛋白持續(xù)激活,并加快細(xì)胞惡變。目前,關(guān)于結(jié)直腸癌k-ras基因突變發(fā)生率的報道不盡相同,一般為40%~50%,西方國家發(fā)生率高于東方[9]。本研究中92例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中,共有29例發(fā)生了k-ras突變,占31.5%,其中G12D12例,G13D7例,G12V4例,G12C3例,G13C1例,G12S2例,符合相關(guān)報道[10]。

        鉑類藥物是臨床上治療結(jié)直腸癌最常用的化療藥物,但該藥易產(chǎn)生耐藥性[11]。有研究報道,ERCC1mRNA表達(dá)水平與患者對鉑類藥物的敏感性呈負(fù)相關(guān),其表達(dá)水平越高患者對鉑類藥物的敏感性越低[12]。ERCC1在核苷酸修復(fù)系統(tǒng)中起到限速和調(diào)節(jié)作用,當(dāng)ERCC1mRNA高表達(dá)時,可以使停滯在G2/M期的損傷DNA迅速修復(fù),從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物耐藥,影響治療效果[13]。本研究結(jié)果顯示,不同腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ERCC1mRNA表達(dá)水平(△CT)無統(tǒng)計學(xué)差異,k-ras突變型患者ERCC1mRNA表達(dá)水平顯著高于k-ras野生型患者,Pearson相關(guān)分析顯示ERCC1mRNA表達(dá)水平與腫瘤長度、浸潤深度、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性,與k-ras突變發(fā)生呈正相關(guān)。提示ERCC1與k-ras基因突變在結(jié)直腸癌耐藥機(jī)制中可能起到協(xié)同作用。這對結(jié)直腸癌分子靶向治療對象篩選有一定意義。由于西妥昔單抗主要通過與EGFR競爭性結(jié)合起到抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的作用,而k-ras蛋白是EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的“開關(guān)”分子,該基因突變可以導(dǎo)致EGFR通路異常激活,干擾治療效果[14]。通過檢測腫瘤組織中k-ras突變情況和ERCC1mRNA表達(dá),有助于了解患者對分子靶向治療的敏感性,為聯(lián)合西妥昔單抗化療提供增效依據(jù)。

        綜上所述,結(jié)直腸癌k-ras突變與ERCC1mRNA表達(dá)密切相關(guān),二者可能與結(jié)直腸癌化療聯(lián)合西妥昔單抗治療耐藥有一定關(guān)系。

        (作者單位:貴航集團(tuán)三0二醫(yī)院)

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