●李昭君

通過(guò)CRISPR Cas/9系統(tǒng)敲除ICP227蛋白基因抑制單純孢疹病毒HSV-1的復(fù)制

●李昭君

CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)是基于細(xì)菌或古細(xì)菌 CRISPR 介導(dǎo)的獲得性免疫系統(tǒng)衍生而來(lái)，由一段 RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別 DNA，指導(dǎo)Cas9 核酸酶切割識(shí)別的雙鏈 DNA，誘發(fā)同源重組或非同源末端鏈接，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在目的 DNA 上進(jìn)行編輯。病毒通過(guò)特異的受體侵染細(xì)胞[1]，其基因組在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程完成其生活周期，某些 DNA 病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組會(huì)整合到宿主基因組中。基因治療是病毒感染疾病治療的新趨勢(shì)，因此，基因編輯技術(shù)在持續(xù)感染的病毒或潛伏感染病毒疾病治療中具有重大的潛在意義。本文我們利用 CRISPR-Cas9 敲除HSV-1病毒復(fù)制過(guò)程中重要基因，從而抑制病毒的復(fù)制，對(duì)病毒感染的治療中有重要意義。

CRISPR Cas/9系統(tǒng)；ICP27蛋白；HSV-1病毒

隨著測(cè)序技術(shù)以及大數(shù)據(jù)信息科學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多導(dǎo)致疾病的基因突變己經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。不僅如此，如今的技術(shù)己經(jīng)可以預(yù)測(cè)一些疾病的發(fā)生可能與基因組上哪些DNA突變相關(guān)。近十年來(lái)，ZFN和TALE N人工核酸酶的出現(xiàn)改變了整個(gè)基因編輯領(lǐng)域過(guò)去的面貌。但是ZFN的特異有時(shí)受到相鄰模塊的影響，TALEN的DNA結(jié)合域存在大量的重復(fù)序列，給載體的構(gòu)建帶來(lái)相當(dāng)?shù)碾y度，因此并沒(méi)有被廣泛應(yīng)用。就在TALEN技術(shù)出現(xiàn)后不久，CRISPR／Cas技術(shù)的出現(xiàn)很好地解決了這些問(wèn)題。CRISPR／Cas系統(tǒng)的核心由Cas9蛋白以及單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA）組成。前者扮演核酸酶的作用，后者則負(fù)責(zé)引導(dǎo)Cas9蛋白與靶序列的結(jié)合。CRISPR／Cas系統(tǒng)要發(fā)揮功能必須滿(mǎn)足兩個(gè)條件：一個(gè)是SgRNA與靶點(diǎn)DNA序列按照堿基互補(bǔ)原則配對(duì)；另一個(gè)是在與SgRNA配對(duì)的靶序列3＇端必須緊跟PAM序列。由于CRISPR／Cas系統(tǒng)靶向新的靶點(diǎn)只需要合成新的SgRNA，相較于ZFN和TALEN更為靈活，且操作簡(jiǎn)便，效率更高，所以在基因編輯領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)包含兩大部分，一個(gè)是前間區(qū)序列臨近基序PAM(NGG)序列，它主要起定位功能，Cas9必須識(shí)別出PAM序列才會(huì)切割病毒DNA。 PAM序列的存在阻止了Cas9攻擊細(xì)菌自身包含記憶的DNA 。另一部分就是向?qū)蛄衧gRNA ，sgRNA的設(shè)計(jì)和選擇是Crispr-Cas9技術(shù)的精髓，也是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵一 步。sgRNA決定了Cas9的靶向性和特異性。對(duì)于目前廣泛應(yīng)用的土壤農(nóng)桿菌系 統(tǒng)來(lái)說(shuō)：sgRNA序列的3‘端必須是NGG序列（Cas9會(huì)在PAM序列5‘端大約3bp處對(duì)DNA 序列進(jìn)行切割。

2 實(shí)施方法設(shè)計(jì)

2.1 目的基因的CDS區(qū)域選擇

2.1.1 選擇依據(jù)

HSV-1基因可分為立即早期基因（IE）、早期基因（E）、和晚期基因。立即早期基因轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)在病毒的DNA復(fù)制之前，立即早期基因轉(zhuǎn)錄后，激活隨后的早期基因和晚期基因，引起病毒的復(fù)制及感染。其中，ICP27蛋白就屬于IE基因編碼的蛋白之一[2]，在HSV-1生命周期的IE期產(chǎn)生，主要調(diào)節(jié)病毒和宿主細(xì)胞mRNA的合成與成熟，敲除ICP27可阻斷HSV-1病毒的復(fù)制，是HSV-1復(fù)制必需的高保守蛋白，而且與其他孢疹病毒的基因產(chǎn)物存在較高的同源性。因此我們決定將Crispr的靶序列定位在ICP27蛋白的編碼區(qū)（CDS區(qū)域）。

2.1.2 查找CDS區(qū)域

我們通過(guò)NCBI網(wǎng)站查找ICP27的編碼區(qū) ，首先通過(guò)文獻(xiàn)查閱，得知HSV-1的登錄號(hào)為NC001806, 通過(guò)查找HSV-1之后查找ICP27蛋白，最終得到ICP27蛋白的CDS區(qū)的堿基序列，大約1500多個(gè)堿基對(duì)。

2.2 選擇最佳目標(biāo)序列，確定剪切位點(diǎn)

運(yùn)行http∶//crispr.mit.edu/ 分析軟件，將編碼ICP27 蛋白的CDS序列分段輸入到在線(xiàn)免費(fèi)設(shè)計(jì)sgRNA的軟件Input框中，然后進(jìn)行設(shè)計(jì)運(yùn)算，會(huì)按照分?jǐn)?shù)由高到低自動(dòng)輸出目標(biāo)序列，從中選取分?jǐn)?shù)最高，脫靶最少的目標(biāo)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。通過(guò)分析比對(duì)，我們得出一條得分最高，脫靶最少的一條序列，即GATACTCGACGCCGCTCGCC CGG。

2.3 重組載體的構(gòu)建

重組載體中需包含sgRNA, 表達(dá)Cas9蛋白的基因，以及篩選用的EGFP(增強(qiáng)綠色熒光蛋白)或者Puro(嘌呤霉素)，然后給予公司合成。

2.4 重組載體的轉(zhuǎn)染與篩選

需先摸索病毒與細(xì)胞的使用比例，即 MOI 值。使細(xì)胞感 染慢病毒，經(jīng)適宜濃度的 Puro進(jìn)行抗藥性篩選或使用EGFP(增強(qiáng)綠色熒光蛋白) 進(jìn)行熒光測(cè)定，得到穩(wěn)定表達(dá) CAS9 和 sgRNA 的混 合克隆細(xì)胞株，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的敲除。

2.5 檢測(cè)sgRNA活性

靶序列經(jīng)過(guò) CAS/sgRNA 切割后由于缺乏修復(fù)模板，將主要以非同源重組的 方式進(jìn)行修復(fù)。因此將靶序列 PCR 擴(kuò)增后經(jīng)過(guò)變性，退火，將形成錯(cuò)配。錯(cuò)配酶將 識(shí)別錯(cuò)配的雜合雙鏈并且剪切。產(chǎn)物跑電泳，比較切割條帶與未切割條帶的比例， 即可反映出 Cas9/sgRNA 的活性。

2.6 驗(yàn)證sgRNA有效性

培養(yǎng)病毒細(xì)胞，觀(guān)察細(xì)胞的死亡率。若sgRNA序列有效，則導(dǎo)入sgRNA序列的細(xì)胞能殺死病毒，比現(xiàn)有藥物更有效。

3 結(jié)語(yǔ)

由 細(xì) 菌 免 疫 系 統(tǒng) 衍 生 的 新 的 基 因 編 輯 技 術(shù) CRISPR-Cas9 與ZFN 和TALEN 相比較，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、應(yīng)用靈活、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在敲除細(xì)胞表面受體和切割病毒基因組、抑制病毒復(fù)制中有顯著效果?？梢哉f(shuō)，在未來(lái)臨床應(yīng)用以及基因治療中還有很長(zhǎng)的一段路要走，還有很大改進(jìn)空間，比如提高 Cas9編輯的準(zhǔn)確性，避免脫靶現(xiàn)象出現(xiàn)[3]；高效的導(dǎo)入細(xì)胞方法以及確保細(xì)胞靶向性等等。研究人員需要不斷 優(yōu) 化系 統(tǒng) ， 通 過(guò) 改 造 CIRSPR 編 輯 方 法 ，降低脫靶效應(yīng)；采用腺病毒載體提高 Cas9基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等。CRISPR-Cas9 作為新的基因編輯技術(shù)，在慢性病毒感染或潛伏病毒感染疾病中具有巨大的潛在科學(xué)研究和臨床治療意義。

（作者單位：山東中醫(yī)藥大學(xué)）

[1]殷利眷,胡斯奇,郭斐. CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在病毒感染疾病治療中的應(yīng)用[J]. 遺傳,2015,(05):412-418.

[2]賈麗潔. ICP27特異性siRNA抑制HSV-1病毒復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究[D].鄭州大學(xué),2010.

[3]趙海衛(wèi),呂欣,尹文. CRISPR/Cas9系統(tǒng)——靶向基因組編輯的新策略[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2015,(03):281-284.