李劍波, 王雪梅, 包寶亮, 何玉林, 王相成,張國建, 白　俠, 劉　磊

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科, 呼和浩特 010050)

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DNA三角雙錐結構的放射性標記

李劍波, 王雪梅, 包寶亮, 何玉林, 王相成,張國建, 白俠, 劉磊

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科, 呼和浩特 010050)

分別采用點擊化學方法對DNA三角雙錐結構進行氟-18標記研究, 采用二氯亞錫還原法對DNA三角雙錐結構進行锝-99m標記研究. 結果表明， 點擊化學方法不適用于DNA三角雙錐結構的氟-18標記; 而采用二氯亞錫還原法則制得了以DNA三角雙錐結構為載體的分子影像探針99mTc-DBNs.

DNA三角雙錐結構; 放射性標記; 氟-18; 锝-99m

分子影像技術是一種實時影像技術, 它利用某個合適的探針可以無侵襲地研究受體表達狀況, 從而在分子和細胞水平上對人體或者其它生命體中特定分子的信號進行檢測[1]. 分子影像技術在臨床上的應用有助于了解疾病的機制、 診斷疾病、 監(jiān)測疾病的進展并提高治療效果[2～4]. 近年來, 分子影像技術發(fā)展迅速, 涉及生物、 醫(yī)學及藥物研發(fā)等多個領域[5～7].

分子影像技術的發(fā)展不僅依靠于高性能的影像設備, 更對性能優(yōu)良的分子影像探針提出了高要求[8,9]. DNA多面體結構具有納米級結構, 其結構穩(wěn)定、 易于合成、 生物相容性好且可以進行精確的修飾和定位. 因此, DNA多面體結構在分子影像、 藥物載帶及靶向治療等方面受到關注[10～16]. 據(jù)文獻[17]報道, DNA四面體結構載帶siRNA在小鼠體內可實現(xiàn)基因沉默, 說明DNA四面體結構能夠在動物模型體內實現(xiàn)一定的穩(wěn)定性并產(chǎn)生生理作用, 但該方法所使用的熒光分子斷層成像融合CT成像(FMT-CT)的分辨率和靈敏度都有較大限制.

本文使用放射性核素對DNA多面體結構進行標記, 制備了可用于PET或者SPECT顯像的分子影像探針. 通過對DNA三角雙錐結構(DBNs)進行氟-18和锝-99m標記研究, 以得到基于DNA三角雙錐結構為載體的分子影像探針.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

Agilent 1100型色譜儀(美國Agilent公司); Amicon超濾膜(切割分子量為300000, 美國Millipore公司); U-3010型紫外分光光度計(日本 Hitachi公司).

1.2實驗過程

1.2.1DBNs的制備與純化參照文獻[18,19]方法, 由一步退火操作合成DBNs, 如Scheme 1所示. 將等摩爾的6條ssDNA(分別標記為a, b, c, A, B和C, 具體的單鏈序列信息參見表1)在TM緩沖液(10 mmol/L Tris-base, 5 mmol/L MgCl2, pH=8.0)中混合均勻, 于95 ℃孵育10 min后, 迅速降溫至4 ℃后孵育20 min, 即得到DBNs.

Scheme 1　Self-assembly process of DBNs

ssDNAOligonucleotidesequenceaAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCbCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGcGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCCACTACTATGGCGACTGCGCGGATGACTCAACTGCCTGGTGATACGATCTAGTCTCTACGTCAAGTAAGAACCTTAGBCCTCGCATGACATCCGCGCAGCTAAGGTTCAAAGTTCCTGCCGCTTCACGGACGGTATTGGACCCTCTTCCCGACCGTGAAGCGGCAGGAACTTATACTTGACGTAGAGACTAGAAGGATGGGCATGT20-a?TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCA20AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

利用體積排阻色譜法(SEC)對產(chǎn)物進行分離純化. 高效液相色譜(HPLC)分析條件, Phenomenex BioSec-SEC-4000型色譜柱(300 mm×7.8 mm); 流動相:NaCl(450 mmol/L)+Tris-HCl(25 mmol/L, pH=7.3); 紫外檢測波長260 nm; 等度洗脫; 流速0.6 mL/min.

帶有側臂鏈(T20)的DBNs由6條ssDNA(分別標記為T20-a*, b, c, A, B和C, 具體的單鏈序列信息參見表1)組成, 其制備和純化過程與DBNs相同.

1.2.2DBNs的表征利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、 熒光共振能量轉移(FRET)、 HPLC和原子力顯微鏡(AFM)對純化后的DBNs進行了表征[19].

1.2.32-[18F]氟乙基疊氮的制備將18F-溶液富集在QMA柱上, 用1 mL Kryptofix 222和K2CO3混合溶液淋洗. 將得到的18F-溶液在95 ℃下用氮氣吹干, 再加入500 μL無水乙腈共沸除水, 重復3次, 保證18F-盡可能處于無水環(huán)境.

2-[18F]氟乙基疊氮參考文獻[20]方法制備. HPLC分析條件:Zorbax C18柱(250 mm×4.6 mm); 流動相A為水相[含三氟乙酸(體積分數(shù)0.1%)], 流動B為乙腈相[含三氟乙酸(體積分數(shù)0.1%)]; 紫外檢測波長220 nm; 梯度條件:0～20 min, 95%A(體積分數(shù))→50%A(體積分數(shù)); 流速1 mL/min.

1.2.4DBNs的氟-18標記在組成DBNs的6條ssDNA中任意選取一條進行炔基修飾, 然后將炔基修飾的ssDNA與其余5條ssDNA混合, 按照1.2.1節(jié)方法制備炔基修飾的DBNs, 再采用與DBNs相同的方法分離純化得到炔基三角雙錐結構(炔基-DBNs).

將一定量的炔基三角雙錐溶液、 CuSO4溶液、 叔丁基三氯乙酰亞胺酯(TBTA)溶液和抗壞血酸鈉溶液, 與200 μL [18F]FEA的乙腈溶液(約200 μCi)混勻后, 在一定的溫度下進行振蕩反應. 從濃度、 用量、 反應溫度、 反應時間和振蕩頻率等方面研究最佳標記條件. 利用Radio-HPLC對標記反應過程進行實時檢測和分析.

1.2.5MAG3-ssDNA的制備與純化將250 μg ssDNA(A20)溶解于4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 0.3 mol/L, pH=8.0)溶液中, 再加入NHS-MAG3(300 μg), 使n(ssDNA)∶n(NHS-MAG3)=1∶20.將混合液在室溫下孵育2 h后, 加入乙酸銨溶液(2 mol/L)終止反應. 將反應溶液通過NAP-5柱進行純化, 以乙酸銨溶液(0.25 mol/L)為洗脫液, 收集純化的MAG3-ssDNA(A20)溶液, 待用.

2　結果與討論

2.1DBNs的制備與純化

Fig.1　HPLC analysis of DBNs

參照文獻[18,19]方法制備DBNs, 并利用HPLC對產(chǎn)物進行了純化. DBNs色譜出峰時間在15～16 min之間(見圖1). 將純化后的DBNs溶液用Amicon超濾膜進行濃縮, 并利用紫外分光光度計測量, 將DBNs溶液濃度調整到合適的濃度備用. 通過PAGE, FRET, HPLC和AFM對產(chǎn)物進行了表征, 證明所得產(chǎn)物為DBNs[19].

2.2[18F]2-氟乙基疊氮的制備

向活化的18F-溶液中加入2-疊氮乙基對甲苯磺酸酯的無水乙腈溶液進行反應, 反應結束后由Radio-HPLC測得[18F]FEA的標記率達到95%以上.

2.3DBNs的氟-18標記

點擊化學(Click chemistry)反應在Cu(Ⅰ)的催化下能夠顯著提高疊氮化合物和端炔修飾化合物的反應速率. 本文采用點擊化學方法對炔基修飾的DBNs進行氟-18標記.

考慮到反應溫度過低不利于標記反應, 故起始反應溫度設定在25 ℃. 隨著溫度的升高, DBNs結構會出現(xiàn)一定量的破壞, 故選擇相對溫和的溫度(25 ℃).

隨著振動頻率的加快, DNA三角雙錐結構會出現(xiàn)一定量的破壞, 實驗將振動頻率設定在500 r/min.

利用點擊化學方法對炔基三角雙錐結構進行氟-18標記, 反應體系中含有Cu2+, TBTA保護劑和抗壞血酸鈉溶液. 以炔基三角雙錐結構的摩爾量為基準, 其余的化合物按照與炔基三角雙錐結構的摩爾比進行添加反應, 結果如表2所示.

Table 2　Amount of each compound in the click reaction*

* Reaction conditions:200 μL [18F]FEA(200 μCi), 25 ℃, reaction frequency 500 r/min.

首先按照Cu2+離子與炔基三角雙錐結構摩爾比為2∶1進行反應(表2中Entry 1), 反應30 min后取樣檢測, 發(fā)現(xiàn)DNA三角雙錐結構被破壞. 考慮到Cu2+離子對DNA結構的破壞作用, 逐步降低Cu2+離子的含量, 同時提高TBTA保護劑的含量(表2中Entries 2～4). 反應開始后, 分別于30和60 min取樣進行HPLC檢測, 發(fā)現(xiàn)DNA三角雙錐結構破壞依然嚴重, 同時由于Cu2+離子未能等摩爾濃度添加, 導致炔基三角雙錐結構的Click反應不成功.

為了保證炔基三角雙錐結構的穩(wěn)定性, 實驗中維持低濃度Cu2+離子, 同時加大TBTA保護劑和抗壞血酸鈉的含量(表2中Entry 5), 反應開始后分別于30, 60和90 min取樣進行HPLC檢測, 發(fā)現(xiàn)反應30和60 min時結構穩(wěn)定, 但是未標記成功; 而90 min時結構破壞嚴重, 仍然未能標記成功. 結果顯示, DNA三角雙錐結構在解鏈后有部分鏈被標記上, 但是結構本身已經(jīng)不完整.

利用點擊化學方法對炔基修飾的DNA三角雙錐結構進行氟-18標記. 結果表明, 反應中標記效果不理想, 炔基三角雙錐結構在標記過程中結構破壞嚴重.

2.4DBNs的锝-99m標記

DBNs的锝-99m標記流程如Scheme 2所示.

Scheme 2　Schematic diagram of radiolabeling DBNs with technetium-99m

Fig.2　HPLC analysis of 99mTc-DBNs(A) Radioactive detector; (B) UV detector.

參照文獻[19]方法, 將MAG3配體基團偶聯(lián)在ssDNA(A20)上, 得到MAG3-ssDNA(A20); 隨后使用二氯亞錫還原法對MAG3-ssDNA(A20)進行锝-99m標記, 再將锝-99m標記的A20單鏈與含有T20手臂鏈的DBNs進行雜交, 標記反應的時間通常約為30 min, 利用Radio-HPLC進行分析放化產(chǎn)率, 反應標記率在90%以上, 產(chǎn)物放化純度大于90%. 如圖2所示, 锝-99m標記DNA三角雙錐結構(99mTc-DBNs)的放射性信號的保留時間為13.8 min. 可見, 利用锝-99m對DNA三角雙錐結構進行標記, 制得了99mTc-DBNs分子探針.

3　結　　論

研究了DNA三角雙錐結構的氟-18和锝-99m的標記方法, 實驗結果表明, 點擊化學方法不適用于DNA三角雙錐結構的氟-18標記; 而通過二氯亞錫還原法制得了99mTc-DBNs分子探針, 發(fā)展了一類以DNA多面體結構為載體的分子影像探針.

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(Ed.:P, H, D, K)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360227) and the Natural Science Foundation of Inner Mongolia, China[No.2015BS(LH)0803].

Radiolabeling of DNA Bipyramid Nanostructures?

LI Jianbo*, WANG Xuemei, BAO Baoliang, HE Yulin, WANG Xiangcheng,ZHANG Guojian, BAI Xia, LIU Lei

(Department of Nuclear Medicine, Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital, Hohhot 010050, China)

DNA bipyramid nanostructures were radiolabeled with fluorine-18 through click chemistry. Reactant concentration, catalyst dosage, reaction time, temperatureand reaction frequency in the CuAAC reaction were studied. DNA bipyramid nanostructures were also radiolabeled with technetium-99m through stannous chloride lableling method. The results showed that it was not a good idea to radiolabel DNA bipyramid nanostructures with fluorine-18 through click chemistry. At the same time99mTc-DBNs were successfully prepared. Radioactive molecular imaging probes would be obtained based on the nanoplatforms of DNA bipyramid nanostructures.

DNA bipyramid nanostructure; Radiolabeling; Fluorine-18; Technetium-99m

10.7503/cjcu20160407

2016-06-06. 網(wǎng)絡出版日期:2016-08-23.

國家自然科學基金(批準號:81360227)和內蒙古自治區(qū)自然科學基金[批準號:2015BS(LH)0803]資助.

O621.3

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聯(lián)系人簡介:李劍波, 男, 博士, 助理研究員, 主要從事分子影像探針方面的研究. E-mail:lijianbo_1235@163.com