何　玨，彭　濤，韓巧秀，王珍玲，鄧　曉，張文書

(1.贛南醫(yī)學院病理學教研室；2.贛州市腫瘤醫(yī)院婦瘤科，江西　贛州　341000)

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SALL4在惡性生殖細胞腫瘤病理診斷中的應用探討*

何玨1，彭濤2，韓巧秀1，王珍玲1，鄧曉1，張文書1

(1.贛南醫(yī)學院病理學教研室；2.贛州市腫瘤醫(yī)院婦瘤科，江西贛州341000)

目的:檢測SALL4在惡性生殖細胞腫瘤(malignant germ cell tumor，MGCT)中的表達，探討其在MGCT病理診斷中的意義。方法:收集經(jīng)手術切除、資料完整、來自性腺及性腺外的MGCT 80例作為研究組，其中無性細胞瘤22例，精原細胞瘤20例，卵黃囊瘤16例，未成熟性畸胎瘤12例，混合性生殖細胞腫瘤8例，胚胎性癌2例；選取同期手術切除的非生殖細胞性惡性腫瘤(No malignant germ cell tumor，NMGCT)標本40例作為對照組；應用常規(guī)病理學技術、免疫組化二步法增強型辣根酶聚合物(Polink-2HRP)染色系統(tǒng)，對全部120例腫瘤進行石蠟切片、HE染色和免疫組化SALL4標記，光學顯微鏡下觀察評估。結果:MGCT的病理形態(tài)各有特點，免疫組化標記SALL4顯色為核陽性，在80例MGCT中,73例為強陽性表達, 未成熟性畸胎瘤有5例弱陽性、2例陰性，總計陽性率97.5%；對照組40例NMGCT中，5例弱陽性，余陰性，陽性率12.5%；經(jīng)χ2檢驗P<0.05，差異具有顯著意義。結論:在性腺及性腺外MGCT中，以免疫組化的方法，檢測干細胞標記物SALL4的表達，證實SALL4在MGCT的病理診斷中的重要作用，可為MGCT的臨床診療提供可靠依據(jù)。

惡性生殖細胞腫瘤；SALL4；病理診斷；免疫組織化學

惡性生殖細胞腫瘤(malignant germ cell tumor，MGCT)是由原始生殖細胞和多能胚細胞轉化而來的惡性腫瘤，兒童好發(fā)于0～4歲，成人好發(fā)于18～40歲。其組織類型復雜多樣，包括精原細胞瘤、無性細胞瘤、卵黃囊瘤、胚胎性癌、絨毛膜癌、未成熟性畸胎瘤、混合性生殖細胞腫瘤等；主要發(fā)生在性腺器官，性腺外常發(fā)生在中線附近，如縱膈、骶尾部、腹膜后、松果體等部位[1]；大多MGCT惡性度高、進展快、易轉移，治療主要以手術切除為主，合理的放、化療對患者的預后起著至關重要的作用，準確且及時的病理診斷是治療效果的重要保證[2]。

MGCT的病理診斷主要依靠HE染色光學顯微鏡下形態(tài)學觀察，由于其類型多、形態(tài)復雜多樣，在臨床實踐中甄別難度較大，容易發(fā)生誤診[3]。為解決MGCT病理診斷中的疑難問題，筆者研習近年腫瘤分子生物學的發(fā)展趨勢，參考國內(nèi)外相關課題研究進展，結合臨床實踐設計方案，使用免疫組化半定量檢測MGCT中人類婆羅雙樹樣基因-4(Sal-like protein4，SALL4)的表達，效果良好，現(xiàn)報告如下。

1　資料和方法

1.1臨床資料收集贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院自2009年1月～2014年12月手術切除的符合WHO腫瘤分類及權威專著MGCT病理診斷標準[4-5]的MGCT 80例，其中來自卵巢MGCT 48例，包括無性細胞瘤22例、卵黃囊瘤14例、未成熟性畸胎瘤10例、混合性生殖細胞腫瘤2例；來自睪丸的MGCT 24例，其中精原細胞瘤16例、卵黃囊瘤2例、胚胎癌2例、混合性生殖細胞腫瘤4例；縱膈MGCT 5例，其中精原細胞瘤4例、未成熟性畸胎瘤1例；骶尾部2例，其中未成熟畸胎瘤1例，混合性MGCT 1例；顱內(nèi)混合性MGCT 1例?；颊吣行?9例，女性51例，年齡2～55歲，中位年齡36.5歲，男女比例為1∶1.76。選取同期手術切除的非生殖細胞性惡性腫瘤(No malignant germ cell tumor，NMGCT)標本40例作為對照研究，對照組均為女性，年齡17～61歲，中位年齡46歲；其中卵巢高級別漿液性癌12例、惡性Brenner瘤5例、透明細胞癌5例、粒層細胞瘤10例、淋巴瘤2例、神經(jīng)內(nèi)分泌癌2例，子宮彌漫性大B細胞淋巴瘤2例、高級別內(nèi)膜間質肉瘤1例，腹股溝轉移性無色素性黑色素瘤1例。研究組及實驗組全部病例選取均符合倫理道德標準，并經(jīng)贛南醫(yī)學院倫理委員會批準、研究對象知情同意。

1.2研究方法全部80例MGCT及40例NMGCT均常規(guī)規(guī)范取材，4%中性甲醛固定，系列乙醇脫水，石蠟包埋，4 μm切片，蘇木素-伊紅(H&E)染色，光鏡觀察。同步采用二步法增強型辣根酶聚合物(Polink-2HRP)非生物素染色系統(tǒng)對全部研究腫瘤組織進行IHC標記，對組織切片常規(guī)脫蠟、水化預處理，置于3%H2O2水溶液中孵育，PBS沖洗；依次滴加一抗、聚合物增強劑，HRP聚合物，并在每次滴加試劑后37 ℃孵育1/3～2 h，PBS標準化沖洗；其后DAB顯色，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固；以PBS代替一抗為陰性對照，陽性對照為羅氏商供；標記抗體為SALL4及相關腫瘤組合抗體。

1.3IHC評價由2名以上高年資病理醫(yī)生采用雙盲法，依據(jù)國際標準化評價[6],經(jīng)光學顯微鏡觀察共同完成；SALL4為核陽性，以染色強度和染色范圍進行綜合評分；隨機選取10個視野，計數(shù)200個細胞，以10%～25%為(+)，25%～50%為(++)，>50%(+++)；以棕黃色為陽性，淡黃為弱陽性，不著色為陰性。

1.4統(tǒng)計學方法使用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，比較SALL4在MGCT與NMGCT中的表達關系，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1MGCT的病理形態(tài)及免疫組化表達光鏡下HE染色時見MGCT形態(tài)各異，無性細胞瘤由大而一致的多邊形細胞構成，瘤細胞聚集成大小不等的細胞巢，周圍有纖維組織分隔，瘤細胞胞質豐富，核大居中(圖1)；卵黃囊瘤內(nèi)多種形態(tài)混合存在，見微囊、網(wǎng)狀、腺泡、腺管、乳頭等結構，并可見內(nèi)胚竇樣結構，細胞異型性較大，核仁突出(圖2)；胚胎性癌由原始上皮樣細胞構成，呈實性巢片狀，見彌漫性壞死，細胞多形性異型性明顯(圖3)；未成熟性畸胎瘤見數(shù)量不等的未成熟組織，極性缺失，以柱狀細胞及原始小圓細胞構成的神經(jīng)管為特征(圖4)；混合性MGCT由2種以上的腫瘤成分構成,其內(nèi)可見無性細胞瘤、精原細胞瘤、卵黃囊瘤、胚胎癌、畸胎瘤、絨癌等形態(tài)特點。經(jīng)Polink-2HRP系統(tǒng)標記，SALL4在MGCT中IHC顯色為核陽性(圖5、圖6、圖7)；在80例MGCT中,73例腫瘤為彌漫強陽性表達, 未成熟性畸胎瘤陽性表達在幼稚的神經(jīng)上皮組織(圖8),其中5例弱陽性、2例陰性，總計研究組陽性率97.5%； 在40例NMGCT中，5例高級別漿液性癌呈弱陽性表達，余陰性，對照組陽性率12.5%；其表達結果見表1。

圖1無性細胞瘤，細胞多邊形巢狀分布，胞質空淡，核仁明顯，間質見淋巴細胞浸潤(H&E，×200)

圖2卵黃囊瘤，見卵黃囊樣結構,中央為纖維及血管軸心,外周排列異型明顯的腫瘤細胞(H&E，×200)

圖3胚胎性癌,癌細胞排列成巢狀,異型明顯,核分裂多, 見大片組織壞死 (H&E，×200)

圖4未成熟性畸胎瘤(G3)，見柱狀細胞及原始小圓細胞構成的未成熟神經(jīng)管組織，排列缺乏極性( (H&E，×200)

圖5SALL4在卵黃囊瘤的瘤細胞核中彌漫性強陽表達，間質及血管陰性(Polink-2HRP，×200)

圖6SALL4在無性細胞瘤的瘤細胞核中彌漫性強陽表達(Polink-2HRP，×200)

圖7SALL4在胚胎癌的腫瘤細胞核中強陽表達，壞死區(qū)域不著色(Polink-2HRP，×200)

圖8SALL4在未成熟性畸胎瘤的幼稚神經(jīng)上皮組織中陽性表達，核陽性(Polink-2HRP，×200)

表1　SALL4在MGCT和NMGCT中的表達

注:*與對照組(NMGCT)相比P<0.05。

2.2統(tǒng)計學結果對實驗結果采用SPSS 20.0進行處理，經(jīng)兩兩對照分析，SALL4在研究組和對照組中的表達P<0.05，統(tǒng)計有差異性。

3　討　論

MGCT是發(fā)生于性腺(睪丸、卵巢)或性腺外組織的惡性腫瘤，由原始生殖細胞和多能胚細胞轉化而來；其組織類型復雜多樣，可表現(xiàn)為精原細胞瘤、無性細胞瘤、卵黃囊瘤、胚胎性癌、絨毛膜癌、混合性生殖細胞腫瘤等等；大多發(fā)生在卵巢和睪丸，性腺外常發(fā)生在中線附近，如縱膈、骶尾部、腹膜后、松果體等部位[7]；除無性細胞瘤外，MGCT惡性度高、進展快、易轉移，治療主要以手術切除為主，合理的放、化療對患者的預后起著至關重要的作用，準確而及時的病理診斷是有效治療的重要保證[8]。

在臨床實踐中,MGCT的病理診斷主要依靠HE染色光學顯微鏡下形態(tài)學觀察，由于其類型多、形態(tài)復雜多樣，與其它類型的NMGCT形態(tài)重疊多，較易發(fā)生誤診，常需要IHC抗體標記以輔助診斷和鑒別診斷；傳統(tǒng)免疫組化抗體主要以CK、EMA、CD117、SOX2、AFP、glypican-3、P53、Ki-67等為主，其特異性和敏感性均受客觀因素影響，在臨床使用中效果不夠理想；為解決MGCT的病理診斷疑難，筆者結合國內(nèi)外相關研究，在MGCT病理診斷中使用特異性和敏感性較強的癌基因SALL4[9]，結合傳統(tǒng)上皮、性索間質抗體進行腫瘤基因研究，可有效彌補傳統(tǒng)免疫組化抗體表達在特異性和敏感性方面的不足，對MGCT進行明確分類。

SALL4基因是2002年由AL-Baradie等發(fā)現(xiàn)的一種鋅脂蛋白轉錄因子，是果蠅Splat(8a1)的同源異型基因，定位于人類染色體20q13，包括SALL4A 和SALL4B 兩種亞型。研究證實SALL4是調(diào)控SALL基因家族表達的主要因子，可通過調(diào)節(jié)自身表達或另一轉錄因子OCT4表達的方式，進而調(diào)控其他SALL基因家族成員的表達；是維持胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)功能的重要調(diào)控基因，在細胞周期調(diào)控及細胞凋亡中起重要作用，SALL4可通過影響表觀遺傳學機制進而調(diào)控干細胞自我更新過程[10-11]。SALL4與其他轉錄因子包括OCT4 和SOX2等相互作用，形成復合體并與OCT-SOX元件結合，共同維持ESC的多能性。

有研究證實SALL4在卵巢畸胎瘤大部分未成熟成分中呈陽性表達，而在成熟成分中呈陰性表達； Cao等通過對睪丸腫瘤、Mei等對中樞神經(jīng)系統(tǒng)GCT、和Wang等對性腺外卵黃囊瘤進行免疫組織化學研究發(fā)現(xiàn)，SALL4可成為MGCT(卵黃囊瘤、無性細胞瘤、精原細胞瘤、胚胎癌、絨毛膜癌、未成熟性畸胎瘤等)一個非常敏感而特異的標志物[12-13]。Markku M等通過對3 215例腫瘤標本的系統(tǒng)性免疫組化研究， 證實SALL4 是一種非畸胎瘤類生殖細胞腫瘤非常好的標志物,同樣可不同程度的表達于其他腫瘤中, 比如淋巴瘤、急性白血病、肝癌、胃癌、腎母細胞瘤、惡性黑色素瘤等,這可能反映了惡性腫瘤的類干細胞分化[14-15]。

本課題以MGCT為研究對象，采用Polink-2HRP染色系統(tǒng)，檢測MGCT中SALL4基因的表達，結果顯示,SALL4在研究組80例MGCT中,73例為強陽性表達, 未成熟性畸胎瘤有5例弱陽性、2例陰性，總計陽性率97.5%；對照組40例NMGCT中，5例弱陽性，余陰性，陽性率12.5%；所選對照組NMGCT形態(tài)特點與MGCT極其相似，比如1例腹股溝轉移性無色素性黑色素瘤，細胞呈大多邊形,胞質透明,呈巢片狀, 光學顯微鏡下極難與無性細胞瘤鑒別；經(jīng)IHC標記，SALL4呈陰性表達,而HMB45陽性表達，為典型的惡黑免疫構型。胚胎性癌細胞異型性大,排列缺乏極性,伴大片壞死，與高級別漿液性癌及惡性Brenner瘤有較多組織學重疊，SALL4彌漫性強陽表達可以很好的鑒別。未成熟性畸胎瘤中SALL4的表達呈現(xiàn)不同程度的差異，陽性表達在未成熟的神經(jīng)管組織,有弱陽性及陰性結果,這可能與腫瘤分化過程中的演變有一定的關系[16]。本文研究結果與文獻報道吻合，但由于樣本較少,未能有更多的發(fā)現(xiàn)。另外,本研究剔除了診斷原則獨特的男性睪丸畸胎瘤，因為睪丸畸胎瘤在成年人大多為惡性，兒童大多為良性；剔除了惡性成分為上皮性腫瘤的女性惡性畸胎瘤[17]；減少了實驗判斷中的混亂和假陰性數(shù)據(jù)。

綜上所述，在性腺及性腺外MGCT中檢測SALL4的表達，可以解決MGCT臨床病理診斷與鑒別診斷中的疑難問題，提高MGCT診斷的準確性，為MGCT的臨床診斷和治療提供科學依據(jù)；進而正確指導臨床對手術方式進行選擇，正確監(jiān)測腫瘤術后復發(fā)或轉移及其預后的研判；對于患者的治療及預后指導產(chǎn)生科學而重要的積極影響；若能在本實驗的基礎上開發(fā)出MGCT相關的靶向藥物，則會為醫(yī)學事業(yè)的發(fā)展做出價值更大的貢獻。

針對MGCT，準確、及時的診斷可為患者提供最佳的治療方案，減少住院時間，降低醫(yī)療費用，延長患者生存期，有很好的社會及經(jīng)濟效益。

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The Application of SALL4 in the Pathological Diagnosis of Malignant Germ Cell Tumors

HEJue1,PENGTao2,HANQiao-xiu1,WANGZhen-ling1,DENGXiao1,ZHANGWen-shu1

(1.DepartmentofTeachingandResearch,GannanMedicalUniversity；2.DepartmentofFemaleTumor,TumorHospitalofGanzhou,GanzhouJiangxi341000)

Objectives:To study the expression of Sal-like protein4 (SALL4) in malignant germ cell tumor (MGCT) and its significance in MGCT pathological diagnosis. Methods: There were 80 cases of MGCT samples from the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, including 22 cases of dysgerminomas, 20 cases of seminomas，16 cases of yolk sac tumors, 12 cases of immature teratomas, 8 cases of mixed germ cell tumors, and 2 cases of embryonal carcinomas, These samples were collected from January 2009 to December 2014. Fourty cases of nonmalignant germ cell tumors (NMGCT), which were removed from female bilateral ovaries in homochronous operations, were taken as the controls. Conventional pathology techniques as well as Polink-2HRP were used for paraffin embedding, HE staining, and immunohistochemistry staining of SALL4 for all 120 samples. The tissues were observed under optical microscopes. Results: Various pathological characterizations were observed for MGCT, and immunohistochemistry staining of SALL4 was positive in nucleus. In 80 cases of MGCT, 73 cases showed strongly positive in SALL4. There were 5 weak positive and 2 negative cases, and the total positive rate was 97.5% for immature MGCT. For 40 cases of controls, 5 cases were positive with weak intensity, and the rest were negative, and the positive rate was 12.5%. Under Chi-square test, the differences of SALL4 positive rates between controls and MGCT group was statistically significant(P<0.05). Conclusion:For the MGCT inside and outside of gonad, the immunohistochemistry staining of stem cell marker SALL the importance of SALL4 in the MGCT pathological diagnosis, which could provide reliable foundation for MGCT clinical diagnosis and treatment.

MGCT; SALL4; Pathological diagnosis; Immunohistochemistry

江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ14690)

R730.2

A

1001-5779(2016)04-0580-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.04.023

2016-08-18)(責任編輯：敖慧斌)